嗜热酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy 中结构域C 的环化重排及其对Gt-amy 催化性能的影响

曾 静，郭建军，涂熠坤，魏国汶，袁 林,*

（1.江西省科学院微生物研究所，江西 南昌 330096；2.南京工业大学化学与分子工程学院，江苏 南京 211800）

生淀粉α-淀粉酶可以在低于糊化温度条件下直接作用于未经蒸煮糊化的生淀粉颗粒，在淀粉液化过程中能够省去生淀粉糊化步骤，有利于节约能源和简化工艺，因此生淀粉α-淀粉酶在酿造、食品、造纸、纺织等领域具有巨大的应用潜力[1-5]。生淀粉α-淀粉酶具有结合到淀粉颗粒表面的淀粉结合域（starch binding domain，SBD），这是它能够直接水解未经糊化处理的生淀粉颗粒的关键[6-7]。SBD属于碳水化合物结合分子[8-9]，作为淀粉酶的天然部分主要有以下作用：使淀粉酶分子可以在溶液中与不溶性底物（淀粉颗粒）结合，将底物运送到催化结构域的活性位点致使淀粉颗粒表面破裂[6-7]。SBD中芳香族氨基酸残基参与生淀粉颗粒的结合，芳香族氨基酸残基的分布会影响其生淀粉结合能力[10]。已有研究显示一些生淀粉酶的生淀粉结合能力和生淀粉降解性能存在相关性，即生淀粉结合能力降低，其生淀粉降解性能也降低。例如，Mehta等[11]通过对Gt-amy II进行SBD缺失突变研究，发现缺失SBD的突变体的生淀粉结合能力和生淀粉降解性能明显降低。但是SBD的生淀粉结合能力与生淀粉α-淀粉酶的生淀粉降解性能之间是否存在正相关性，以及SBD影响生淀粉α-淀粉酶的生淀粉降解性能的分子机制还有待进一步研究。

来源于嗜热菌（Geobacillus thermoleovorans）的α-淀粉酶Gt-amy属于嗜热酸性生淀粉α-淀粉酶，具有优良的高温活性和热稳定性，并且Gt-amy的酶学性质（如热稳定、低pH值、不依赖于Ca2＋）使得其在淀粉液化工艺中具有巨大的应用潜力[12]。Gt-amy属于糖苷水解酶类的第13家族，具有保守区域、催化活性中心、金属离子结合位点和3 个结构域（结构域A、结构域B和结构域C）等[13-16]。Gt-amy的结构域C和来源于Bacillussp. TS-23的α-淀粉酶SBD序列比对结果表明，二者氨基酸序列相似性达95%，Gt-amy的结构域C可能为SBD[12,17]。

蛋白质环化重排是对蛋白质进行分子改造的一种有效手段，是通过共价连接氨基端和羧基端，裂解某个肽键重新获得新的氨基端和羧基端的过程[18]。采用环化重排处理使得蛋白质的分子结构发生改变，从而改变蛋白质的性质，如提高蛋白质催化能力、配体亲和性、改变底物选择性、改变低聚反应状态和提高蛋白质稳定性等[19]。例如，Stephen等[20]对糖化酶RoGA的SBD进行环化重排突变，获得了生淀粉结合率提高的突变体CP90。本研究拟采用基于蛋白质分子结构的环化重排方法对Gt-amy的结构域C进行分子改造，获得结构域C的环化重排突变体，并用结构域C的环化重排突变体替换Gt-amy中结构域C获得对应的Gt-amy环化重排突变体。通过比较环化重排突变体的生淀粉吸附率和生淀粉降解率，分析Gt-amy的生淀粉结合能力与生淀粉降解性能之间是否存在相关性，以及阐述结构域C影响Gt-amy催化性能的可能分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大肠杆菌（Escherichia coli）JM109、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）WB600、枯草芽孢杆菌表达载体pSTOP1622、Gt-amy表达载体pSTOP1622-gtamyhds均由本实验室保存。

KOD-Plus-neo DNA聚合酶 日本Toyobo公司；DNA限制性内切酶、T4 DNA连接酶、DNA Marker、蛋白质Marker 美国Fermentase公司；DNA胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒E.Z.N.A. 美国Omega Bio-Tek公司；In-Fusion®HD Cloning kit 日本TaKaRa公司；Chelating SepharoseTMFast Flow 美国GE Healthcare公司；玉米淀粉 美国Sigma公司；Bradford法蛋白浓度测定试剂盒、木糖、咪唑 上海生工生物工程股份有限公司；实验所用试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

Mastercycler gradient聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪 美国Eppendorf公司；TY04S-3C凝胶成像系统 北京君意东方电泳设备有限公司；SCIENTZ-IID超声波细胞破碎仪 宁波新芝生物科技股份有限公司；SP-752PC紫外-可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 生物信息学分析

采用Swiss-Model（http：//swissmodel.expasy.org）），以来源于Bacillus stearothermophilus的α-淀粉酶BStA（PDB ID：1hvxA）蛋白质分子结构为模板，模拟Gt-amy结构域C（Tyr428～Pro549）的蛋白质分子结构[21]。将Gt-amy结构域C的蛋白质分子结构信息（模拟得到的三级结构信息）输入到在线软件Cpred（http：//sarst.life.nthu.edu.tw/CPred）[22]中，得出SBD结构中每一个氨基酸残基作为环化重排突变的概率，选择环化重排突变概率高的氨基酸残基位点进行突变。

1.3.2 重组质粒pSTOP1622-gtamy-DCh的构建及鉴定

以重组质粒pSTOP1622-gtamyhds为模板，以P1和P2为引物进行PCR扩增，获得编码结构域C的基因gtamy-DCh。PCR扩增条件为：94 ℃、5 min预变性；94 ℃、30 s变性，55 ℃、20 s退火，68 ℃、20 s延伸，35 个循环；68 ℃、10 min。扩增产物经BglII和SphI双酶切，连接至载体pSTOP1622，构建重组质粒pSTOP1622-gtamy-DCh。采用BglII和SphI双酶切重组质粒鉴定是否有外源基因的插入。

1.3.3 Gt-amy结构域C环化重排突变体的构建及鉴定

表1 构建重组质粒所用引物Table 1 Primer sequences for the construction of recombinant plasmids

根据α-淀粉酶Gt-amy结构域C中作为环化重排突变位点的氨基酸位点设计引物T432-F1、T432-R1、D441-F1、D441-R1、P454-F1、P454-R1、G465-F1、G465-R1、A479-F1、A479-R1、S491-F1、S491-R1、S498-F1、S498-R1、G508-F1、G508-R1（表1），构建结构域C相关环化重排突变体DC-T432、DC-D441、DC-P454、DCG465、DC-A479、DC-S491、DC-S498、DC-G508。以突变体DC-T432的构建为例，以重组质粒pSTOP1622-gtamy-DCh为模板，采用引物T432-F1和T432-R1，进行PCR扩增得到编码DC-T432的DNA片段。PCR扩增条件同1.3.2节。扩增产物经BglII和SphI双酶切，连接至载体pSTOP1622，构建重组质粒pSTOP1622-gtamy-DCT432h。将重组质粒送至上海生工生物工程股份有限公司进行测序，并与对应基因序列进行比对确认。

1.3.4 Gt-amy环化重排突变体的构建及鉴定

根据α-淀粉酶GT-amy结构域C中作为环化重排突变位点的氨基酸位点设计引物P3、P4、T432-F2、T432-R2、D441-F2、D441-R2、P454-F2、P454-R2、G465-F2、G465-R2、A479-F2、A479-R2、S491-F2、S491-R2、S498-F2、S498-R2、G508-F2、G508-R2（表1），构建Gt-amy相关环化重排突变体Gt-amy-T432、Gt-amy-D441、Gt-amy-P454、Gt-amy-G465、Gt-amy-A479、Gt-amy-S491、Gt-amy-S498、Gt-amy-G508。以突变体Gt-amy-T432的构建为例，以重组质粒pSTOP1622-gtamyh为模板，以P3、P4为引物，进行PCR扩增得到不包含编码结构域C的核苷酸序列的线性载体片段。PCR扩增条件除延伸时间为3 min外，其他同1.3.2节。以重组质粒pSTOP1622-gtamy-DCT432h为模板，以T432-F2、T432-R2为引物，PCR扩增得到包含同源臂和编码突变体DC-T432的核苷酸序列的DNA片段（5’-ATCGCGCGCAGGGAT-DCT432核苷酸序列-CACCATCACCATCAC-3’）。将PCR扩增的线性片段与DNA片段混合，采用In-Fusion®HD Cloning kit进行无缝克隆，获得Gt-amy环化重排突变体Gt-amy-T432的表达载体pSTOP1622-gtamy-T432h。将重组质粒送至上海生工生物工程股份有限公司进行测序，并与对应基因序列进行比对确认。

1.3.5 枯草芽孢杆菌WB600感受态细胞的制备和转化

枯草芽孢杆菌WB600感受态细胞的制备和转化采用改进的Spizizen法[23]进行。

1.3.6 重组蛋白质的诱导表达和纯化

接种重组枯草芽孢杆菌单克隆到LB液体培养基中，250 mL三角瓶中培养，装液量20 mL，37 ℃、200 r/min培养培养10 h。然后转接该培养物于新鲜LB液体培养基中，用250 mL三角瓶进行培养，其中培养基的装液量为25 mL，接种量为3%，培养温度为37 ℃，转速为200 r/min。当培养至菌体OD600nm达到1时，添加终质量浓度为0.5 g/100 mL的木糖，诱导细胞表达重组蛋白质，诱导时间为30 h。

采用Ni2＋亲和层析柱对发酵上清液中目的蛋白质进行纯化，用250 mmol/L咪唑洗脱缓冲液洗脱，即得到纯化后的重组蛋白质。利用聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）检测重组蛋白质的纯度，并采用Bradford法测定重组蛋白质的浓度[24]。

1.3.7 重组蛋白质对玉米淀粉的吸附率及降解率的测定用0.5 m L 5 0 m m o l/L 2-吗啉乙磺酸（2-morpholinoethanesulfonic acid，MES）（pH 5.0）缓冲液配制玉米淀粉溶液（其中玉米淀粉质量分别为0、25、50、75、100、125、150 mg），分别向玉米淀粉溶液中加入50 μL的重组蛋白质（60 μmol/L），混合体系在20 ℃的恒温振荡培养箱孵育3 h，振荡速率为180 r/min。孵育结束后，12 000×g离心10 min，获得沉淀和上清液。采用Bradford法测定上清液中重组蛋白质质量浓度。吸附率计算如式（1）所示：

取30 g/100 mL玉米淀粉的50 mmol/L MES（pH 5.0）缓冲液与0.1 U/mg的酶液混合，于60 ℃反应3 h后，用3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）[25]法测定上清液中还原糖量。α-淀粉酶的玉米淀粉降解率按式（2）计算：

1.3.8α-淀粉酶活力测定

将10 μL酶液与490 μL含1 g/100 mL可溶性淀粉或玉米淀粉的50 mmol/L MES，pH 5.0缓冲液混合，于80 ℃反应30 min后，迅速放入冰水浴中终止反应，然后采用DNS法测定反应体系中还原糖量。酶活力单位定义：在一定反应条件下，每分钟催化产生1 μmol还原糖的酶量为一个酶活力单位（U）。

1.3.9α-淀粉酶的动力学常数测定

用50 mmol/L MES（pH 5.0）缓冲液配制不同质量浓度的可溶性淀粉溶液或玉米淀粉溶液（0.1、0.2、0.5、1、1.5、2、3、4、5 g/100 mL），分别向可溶性淀粉溶液中加入等量的酶液，按照1.3.8节方法测定酶活力。根据双倒数作图法以底物浓度的倒数为横坐标，以酶比活力的倒数为纵坐标作图，直线的斜率为Km/Vmax，截距为1/Vmax，计算以可溶性淀粉为底物时的米氏常数Km、反应常数kcat。

1.4 数据处理

α-淀粉酶的酶学性质研究实验中，每个实验做3 个平行。运用软件SigmaPlot 11.0对实验数据进行统计分析并作图，数据均以表示。

2 结果与分析

2.1 Gt-amy结构域C中环化重排突变位点的选择

采用S w i s s-M o d e l，以来源于B a c i l l u s stearothermophilus的α-淀粉酶BStA（PDB ID：1hvxA）的蛋白质分子结构为模板，模拟Gt-amy结构域C（Tyr428～Pro549）的蛋白质分子结构如图 1所示，其中所获得的结构域C的三级结构图仅能显示氨基酸序列Tyr428～Arg517所构成的蛋白质分子结构。结构域C中每一个氨基酸残基作为环化重排突变位点的概率如图2所示，选择环化重排突变概率高的氨基酸残基位点进行突变。由图2可知，结构域C中可以作为环化重排突变位点的氨基酸残基如下：第432位苏氨酸（T432）、第441位天冬氨酸（D441）、第454位脯氨酸（P454）、第465位甘氨酸（G465）、第479位丙氨酸（A479）、第491位丝氨酸（S491）、第498位丝氨酸（S498）、第508位甘氨酸（G508）。根据以上信息，构建得到结构域C环化重排突变体（DC-T432、DC-D441、DC-P454、DC-G465、DC-A479、DC-S491、DC-S498、DC-G508）的表达载体。在此基础上，采用结构域C环化重排突变体替换Gt-amy的结构域C，构建得到Gt-amy环化重排突变体（Gt-amy-T432、Gt-amy-D441、Gt-amy-P454、Gt-amy-G465、Gt-amy-A479、Gt-amy-S491、Gtamy-S498、Gt-amy-G508）的表达载体。

图1 Gt-amy结构域C的三级结构显示图Fig. 1 Tertiary structure of domain C of Gt-amy

图2 结构域C中环化重排突变位点的概率图Fig. 2 Probability of circulation permutation sites in domain C of Gt-amy

2.2 重组蛋白质的表达与纯化

将重组质粒分别转化枯草芽孢杆菌WB600，获得重组枯草芽孢杆菌并进行诱导表达。结构域C环化重排突变体和Gt-amy环化重排突变体均得到成功表达，且主要位于细胞可溶成分中。采用Ni2＋亲和层析柱对重组细胞可溶成分中的目的蛋白质进行纯化，得到纯化后的重组蛋白质，如图3、4所示。结构域C及其环化重排突变体的表观分子质量约为13 kDa，Gt-amy及其环化重排突变体的表观分子质量约为56 kDa，大小均与理论值相符。

图3 结构域C及其环化重排突变体的SDS-PAGE检测图Fig. 3 SDS-PAGE analysis of domain C and circularly permutated mutants

图4 Gt-amy及其环化重排突变体的SDS-PAGE检测图Fig. 4 SDS-PAGE analysis of Gt-amy and circularly permutated mutants

2.3 重组蛋白质对玉米淀粉的吸附率

为研究结构域C的环化重排突变对其结合玉米淀粉的影响，比较结构域C及其环化重排突变体对玉米淀粉的吸附率，结果如图5所示。在玉米淀粉质量浓度为0～30 g/100mL范围内，结构域C及其环化重排突变体对玉米淀粉的吸附率随着反应体系中玉米淀粉质量浓度的提高而提高。当反应体系中玉米淀粉质量浓度达到30 g/100 mL时，结构域C及其环化重排突变体对玉米淀粉的吸附率达到最高。此外，在玉米淀粉质量浓度0～30 g/100 mL范围内，与野生型的结构域C相比，突变体DC-T432、DC-D441、DC-P454、DC-G508对玉米淀粉的吸附率降低；而突变体DC-G465、DC-S491以及DCS498对玉米淀粉的吸附率提高；突变体DC-A479对玉米淀粉的吸附率基本不变。并且，当反应体系中玉米淀粉质量浓度达到30 g/100 mL时，突变体DC-S498对玉米淀粉的吸附率达到95.78%，而结构域C对玉米淀粉的吸附率为84.52%。即以上重组蛋白质中，DC-S498具有最大值的玉米淀粉吸附率，与结构域C的玉米淀粉吸附率相比，提高了13%。以上结果表明，结构域C的环化重排突变通过改变结构域C的分子结构，使得其对玉米淀粉的吸附率发生变化。

图5 结构域C及其环化重排突变体的玉米淀粉吸附率Fig. 5 Raw corn starch binding rates of domain C and circularly permutated mutants

图6 Gt-amy及其环化重排突变体的玉米淀粉吸附率Fig. 6 Raw corn starch binding rates of Gt-amy and circularly permutated mutants

另外，本研究也进一步比较了Gt-amy及其环化重排突变体对玉米淀粉的吸附率，结果如图6所示。在玉米淀粉质量浓度为0～30 g/100 mL范围内，Gt-amy及其环化重排突变体对玉米淀粉的吸附率的变化趋势与结构域C及其环化重排突变体对玉米淀粉的吸附率变化趋势基本一致。在玉米淀粉质量浓度为0～30 g/100 mL范围内，与野生型的结构域C相比，突变体Gt-amy-T432、Gt-amy-D441、Gt-amy-P454、Gt-amy-G508对玉米淀粉的吸附率降低；而突变体Gt-amy-G465、Gt-amy-S491以及Gt-amy-S498对玉米淀粉的吸附率提高；突变体Gt-amy-A479对玉米淀粉的吸附率基本不变。当反应体系中玉米淀粉质量浓度达到30 g/100 mL时，突变体Gt-amy-S498对玉米淀粉的吸附率达到93.14%，而Gt-amy对玉米淀粉的吸附率为78.86%。即以上重组蛋白质中，Gt-amy-S498具有最大值的玉米淀粉吸附率，与Gt-amy的玉米淀粉吸附率相比，提高了18%。

以上研究结果表明，结构域C的环化重排突变导致其分子结构发生改变，从而改变其对玉米淀粉吸附率。当将Gt-amy中结构域C替换为结构域C的环化重排突变体后，Gt-amy对玉米淀粉的吸附率也发生改变。并且Gtamy及其环化重排突变体对玉米淀粉的吸附率的变化情况与结构域C及其环化重排突变体对玉米淀粉的吸附率的变化情况一致。结构域C的环化重排突变导致玉米淀粉吸附率发生改变的可能原因是，结构域C的环化重排突变使其分子结构发生变化，特别是结构域C中参与生淀粉吸附的氨基酸位点在分子结构中的分布发生了变化[26]。

2.4 重组蛋白质对玉米淀粉的降解率

图7 Gt-amy及其环化重排突变体的玉米淀粉降解率Fig. 7 Raw corn starch hydrolysis rates of Gt-amy and circularly permutated mutants

为研究结构域C环化重排突变对Gt-amy降解玉米淀粉的影响，本研究也比较了Gt-amy及其环化重排突变体对30 g/100 mL玉米淀粉的降解率。由图7可以看出，Gt-amy及其环化重排突变体对玉米淀粉的降解率随着时间的延长而提高。此外，与Gt-amy相比，突变体Gt-amy-T432、Gt-amy-D441、Gt-amy-P454、Gt-amy-G508对玉米淀粉的降解率降低；而突变体Gt-amy-G465、Gt-amy-S491以及Gt-amy-S498对玉米淀粉的降解率提高；突变体Gt-amy-A479对玉米淀粉的降解率基本不变。其中，当反应时间达到3 h，突变体Gt-amy-S498具有最大值的玉米淀粉降解率，其对玉米淀粉的降解率为90.93%，而Gt-amy对玉米淀粉的降解率为65.80%。即与Gt-amy相比，突变体Gt-amy-S498的玉米淀粉降解率提高了38%。以上研究结果表明，结构域C的环化重排突变影响了Gt-amy对玉米淀粉的降解率。

结合结构域C环化重排突变对Gt-amy的玉米淀粉吸附率和玉米淀粉降解率影响的研究结果，可以得出以下结论：玉米淀粉吸附率提高的Gt-amy环化重排突变体，其玉米淀粉降解率也相应提高；玉米淀粉吸附率降低的Gt-amy环化重排突变体，其玉米淀粉降解率也相应降低。并且突变体的玉米淀粉吸附率和玉米淀粉降解率之间只有相对应的提高和降低关系，即两者之间未呈倍数关系，但呈正相关性。已有研究结果显示，提高淀粉酶的生淀粉吸附能力，可以相应提高其生淀粉降解率。例如，Parashar等[27]通过分子改造获得的玉米淀粉吸附率由0.6 μg/mg提高至10 μg/mg的Ba-amy嵌合突变体，其玉米淀粉降解率由5.0%提高至25.6%。

2.5 结构域C的环化重排突变对Gt-amy催化活性的影响

表2 可溶性淀粉为底物的重组α-淀粉酶动力学常数Table 2 Kinetic parameters of recombinant α-amylase with soluble starch as substrate

表3 玉米淀粉为底物的重组α-淀粉酶动力学常数Table 3 Kinetic parameters of recombinant α-amylase with corn starch as substrate

比较Gt-amy及其环化重排突变体对可溶性淀粉和玉米淀粉的酶比活力和动力学常数，确定结构域C的环化重排突变对Gt-amy催化活性的影响。从表2可以看出，以可溶性淀粉为底物时，与Gt-amy相比，Gt-amy环化重排突变体的可溶性淀粉吸附能力未明显改变，反应速率和酶比活力略有下降。从表3可以看出，以玉米淀粉为底物时，与Gt-amy相比，Gt-amy环化重排突变体对玉米淀粉的Km、kcat值和酶比活力均发生明显变化。其中，突变体Gt-amy-T432、Gt-amy-D441、Gt-amy-P454、Gt-amy-G508对玉米淀粉的吸附能力明显降低，反应速率和酶比活力也明显降低；而突变体Gt-amy-G465、Gt-amy-S491以及Gt-amy-S498对玉米淀粉的吸附能力明显提高，反应速率和酶比活力也明显提高；突变体Gt-amy-A479对玉米淀粉的Km、kcat值和酶比活力与Gt-amy基本一致。

以上研究结果表明，结构域C环化重排突变后，生淀粉吸附能力越高的Gt-amy突变体的生淀粉降解能力也越高，但是结构域C环化重排突变对Gt-amy的可溶性淀粉降解能力影响不大。Gt-amy环化重排突变体以可溶性淀粉为底物时反应速率和酶比活力略有下降的可能原因是结构域C的环化重排突变导致酶分子结构发生变化，特别是与Gt-amy高温活性相关的分子结构发生了变化。已有研究表明，位于Gt-amy的结构域A与结构域C之间的Ca2＋结合位点有利于其维持其高温活性[28-29]。结构域C环化重排后，此Ca2＋结合位点相关的氨基酸残基重新排布，破坏了此Ca2＋结合位点，进而导致突变体的高温活性降低。

Gt-amy的氨基酸序列比对结果显示，Gt-amy的结构域C可能为SBD。SBD介导生淀粉酶作用于生淀粉的机理为SBD结构域可以与生淀粉结合从而增加在酶活性中心的生淀粉质量浓度，并且改变生淀粉的结构构象使得其更加接近活性中心[30]。因此SBD生淀粉吸附能力的增强可能会提高生淀粉酶对生淀粉的降解能力，生淀粉酶的生淀粉降解能力和生淀粉吸附能力之间可能存在正相关性。本研究通过对Gt-amy的结构域C进行环化重排突变，证实Gt-amy的生淀粉降解能力和生淀粉吸附能力之间存在正相关性。

3 结 论

本研究通过分析Gt-amy及其环化重排突变体的玉米淀粉吸附率、玉米淀粉降解率、酶比活力和动力学常数，确定了Gt-amy结构域C环化重排突变对其催化性能的影响。结构域C环化重排突变后，生淀粉吸附能力越高的Gt-amy突变体的生淀粉降解能力也越高，但是结构域C环化重排突变对Gt-amy的可溶性淀粉降解能力影响不大。本研究通过对Gt-amy的结构域C进行环化重排突变，提高或降低了Gt-amy的生淀粉吸附能力，进而提高或降低了Gt-amy的生淀粉降解能力，证实Gt-amy的生淀粉降解能力和生淀粉吸附能力之间存在正相关性。但是从Gt-amy结构域C的模拟分子结构尚不能预测其中生淀粉结合位点，因此有关结构域C环化重排突变影响Gt-amy生淀粉吸附能力和生淀粉降解能力的分子机制有待进一步研究。此外本研究也验证了环化重排突变可以作为一种工程学手段改变Gt-amy的催化性能，特别是生淀粉降解能力，同时将来也可以将环化重排突变用于改变其他酶类的蛋白质结构与功能，为提高蛋白质的催化性能提供了思路。