穿心莲内酯和雷公藤多苷抗炎作用的比较研究

刘寅寅， 邹盼盼， 朱莺鸽， 贺 焱， 张梦娟， 陈 超， 刘 畅， 李 磊

(安徽科技学院 动物科学学院，安徽 凤阳 233100)

炎症反应是多种疾病共同的发病基础或病理过程,会造成局部或全身的损伤,严重时可危及生命。一些传统中药的提取物如雷公藤多苷和穿心莲内酯抗炎效果较好。雷公藤多苷(tripterygium glycosides,TG)是从雷公藤根中提取的总苷,用于肾脏疾病[1]、重症肝炎、红斑狼疮等疾病的治疗,具有显著的抗炎及免疫调节、抗肿瘤等作用[2],对类风湿疾病的治疗效果甚佳[3],但由于其存在毒性,尤以肝毒性较大[4],限制了其临床应用。穿心莲内酯(andrographolide,Andro)作为穿心莲中的主要有效成分,具有清热解毒、去肿止痛、抗炎抗菌、抗病毒、免疫调节作用的同时,保肝利胆效果显著[5-6]。因此,本研究将尝试利用穿心莲内酯保肝作用来改善雷公藤多苷的肝毒性,通过小鼠耳肿胀试验、醋酸扭体试验、热板反应和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导炎症模型来研究、比较穿心莲内酯和雷公藤多苷单独使用与配伍使用的抗炎效果,以期判断两者配伍的可行性和临床应用价值,为穿心莲内酯和雷公藤多苷配伍使用提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 体重18～22 g的ICR小鼠,由安徽科技学院实验动物中心提供,于室温下饲养,试验期间小鼠自由进食、饮水。

1.1.2 药品与试剂 羧甲基纤维素钠(批号:F20050621)购于国药集团化学试剂有限公司;穿心莲内酯(批号:C10064882)购于上海麦克林生化科技有限公司;雷公藤多苷片(批号:171103)购于上海复旦复华药业有限公司;醋酸地塞米松片(批号:160402)购于浙江仙琚制药股份有限公司;二甲苯(批号:20170502)购于江苏强盛功能化学股份有限公司;冰乙酸(批号:C10101190)购于上海麦克林生化科技有限公司;脂多糖(LPS,批号:813Q037)购于北京索莱宝科技有限公司。

1.1.3 仪器设备 RB-200智能热板仪 (成都泰盟科技有限公司);LE204E电子分析天平(梅特勒托利多仪器有限公司);IMS-70全自动雪花制冰机(常熟市雪科电器有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 耳肿胀试验 选择30只小鼠适应性饲养7 d,随机分为模型组、地塞米松组、雷公藤多苷组、穿心莲内酯组、穿心莲内酯和雷公藤多苷配伍组,每组6只。模型组按照0.1 mL/10 g灌胃0.5%羧甲基纤维素钠溶液;地塞米松组按照2 mg/kg灌胃地塞米松;雷公藤多苷组按照30 mg/kg灌胃雷公藤多苷;穿心莲内酯组按照20 mg/kg灌胃穿心莲内酯;穿心莲内酯和雷公藤多苷配伍组同时灌胃30 mg/kg的雷公藤多苷和20 mg/kg的穿心莲内酯。连续灌胃5 d,于最后1 d灌胃结束1 h后,将每只小鼠右耳前后均匀涂抹0.02 mL二甲苯,30 min后,将小鼠颈椎脱臼处死,沿小鼠耳廓基线剪下双耳,并用8 mm的打孔器分别于左右两耳相同位置剪下一圆片,立即用分析天平准确称量左右耳片重量,计算耳片肿胀抑制率。

耳片肿胀率(%)=(右耳片质量-左耳片质量)/左耳片质量×100%

耳片肿胀抑制率(%)=(模型组平均肿胀率-药物组平均肿胀率)/模型组平均肿胀率×100%[7]

1.2.2 醋酸扭体试验 取30只雌性ICR小鼠适应性饲养7 d,随机分为空白组、地塞米松组(2 mg/kg)、雷公藤多苷组(30 mg/kg)、穿心莲内酯组(20 mg/kg)、穿心莲内酯和雷公藤多苷配伍组(20 mg/kg+30 mg/kg),每组6只。空白组按照0.1 mL/10 g灌胃0.5%羧甲基纤维素钠溶液,其余各组给予相应药物,连续灌胃5 d,于最后1 d灌胃结束30 min后,按照0.1 mL/10 g给小鼠注射0.7%的醋酸溶液,观察记录20 min内小鼠扭体次数,并计算镇痛百分率。

镇痛百分率(%)=[1-(给药组平均扭体数/空白组平均扭体数)]×100%

1.2.3 热板试验 小鼠分组与给药同醋酸扭体试验。连续灌胃5 d,最后1 d灌胃结束30 min后,将小鼠置于55±5 ℃的热板仪测定其痛阈值(将小鼠放于热板仪上至出现舔足和抖足的时间作为痛阈值(s)),共测定2次,取均值。如60 s仍然没有反应,将小鼠取出,以免烫伤,其痛阈值算作60 s。

1.2.4 LPS诱导小鼠炎症试验 取ICR小鼠30只,雌雄各半,按照体重均衡随机分为空白组、炎症模型组、雷公藤多苷组(30 mg/kg)、穿心莲内酯组(20 mg/kg)、穿心莲内酯和雷公藤多苷配伍组(20 mg/kg+30 mg/kg),每组6只。炎症模型组和空白组按照0.1 mL/10 g·b·w 灌胃0.5%羧甲基纤维素钠溶液,药物用0.5%羧甲基纤维素钠溶液配制,每天灌胃1次,连续5 d。最后1 d灌胃30 min后,除空白组外,均按照5 mg/kg体重腹腔注射脂多糖,6 h后摘眼球取血,检测其血常规和血液生化指标,观察穿心莲内酯与雷公藤多苷单独及其配伍使用对LPS诱导炎症小鼠的保护作用。

1.3 数据处理

结果以“平均值±标准误”表示,采用SPSS 19.0软件对数据进行单因素ANOVA检验,多重比较采用LSD检验,P<0.05表示有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 穿心莲内酯和雷公藤多苷对小鼠耳肿胀率的影响

如表1所示,与模型组相比,雷公藤多苷组、穿心莲内酯组均能显著地抑制二甲苯所以引起的小鼠耳肿胀(P<0.05),地塞米松组、配伍组均能极显著地抑制二甲苯所以引起的小鼠耳片肿胀(P<0.01);与雷公藤多苷组、穿心莲内酯组相比配伍组虽能抑制二甲苯所以引起的小鼠耳片肿胀,但无显著性差异。可见雷公藤多苷和穿心莲内酯配伍使用,抗炎效果优于穿心莲内酯或雷公藤多苷单独使用,但作用不明显。

表1 穿心莲内酯与雷公藤多苷对小鼠耳肿胀率的影响(n=6)

注:同列不同大、小写字母分别表示在0.01和0.05水平上差异显著。下同。

2.2 穿心莲内酯和雷公藤多苷对小鼠醋酸扭体试验的影响

如表2所示,与相比,地塞米松组能显著降低小鼠扭体次数(P<0.05),雷公藤多苷组与穿心莲内酯单独应用及配伍使用均可极显著地降低小鼠扭体次数(P<0.01);与雷公藤多苷组、穿心莲内酯组相比,配伍组虽降低小鼠扭体次数,但无显著性差异。

表2 穿心莲内酯与雷公藤多苷对小鼠扭体次数的影响(n=6)

2.3 穿心莲内酯和雷公藤多苷对小鼠痛阈值的影响

如表3所示,与模型组相比,地塞米松组、雷公藤多苷组、穿心莲内酯组,雷公藤多苷和穿心莲内酯配伍组均能延长小鼠热板反应的痛阈值;与雷公藤多苷组、穿心莲内酯组相比配伍组能延长小鼠热板反应的痛阈值,具有镇痛效果。

表3 穿心莲内酯与雷公藤多苷对小鼠痛阈值的影响(n=6)

2.4 穿心莲内酯和雷公藤多苷对LPS诱导小鼠血清生理生化指标的影响

如表4所示,与空白组相比,经LPS诱导后的炎症小鼠,血液中白细胞含量显著升高(P<0.05),中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞含量极显著升高(P<0.01);与模型组相比,穿心莲内酯和雷公藤多苷单独应用或配伍组均能极显著降低白细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞的含量(P<0.01);雷公藤多苷组或穿心莲内酯组与配伍组相比无显著性差异。

如表5所示,与空白组相比,经LPS刺激后小鼠血清中谷草转氨酶含量显著升高(P<0.05),谷丙转氨酶、尿素氮、肌酐含量极显著升高(P<0.01);与模型组相比,穿心莲内酯和雷公藤多苷单独应用或配伍组均能显著降低小鼠血液中谷草转氨酶活力、尿素氮、肌酐的含量(P<0.05),极显著降低谷丙转氨酶的含量(P<0.01);雷公藤多苷组或穿心莲内酯组与配伍组相比无显著性差异。因此,与穿心莲内酯配伍不能减弱雷公藤多苷的毒性。

表4 穿心莲内酯和雷公藤多苷对LPS诱导的炎症小鼠血液生理指标的影响(n=6)

表5 穿心莲内酯和雷公藤多苷对LPS诱导的炎症小鼠血液生化指标的影响(n=6)

3 结论与讨论

炎症的局部症状多是由于局部血管充血、炎性水肿、细胞变性、坏死等所导致的红、肿、热、痛、机能障碍。较严重时则引起全身反应,造成实质器官的损伤,在由细菌感染而引起的急性炎症中,血液中白细胞数量明显升高[8]。在本研究中LPS诱导小鼠全身炎症反应的血常规检测结果显示,未给药的小鼠经腹腔注射LPS致炎后,血液中各类白细胞数量极显著升高(P<0.01),不论是穿心莲内酯或雷公藤多苷单独给药,还是配伍使用,都能显著或极显著地降低血液中各类白细胞的数量,说明雷公藤多苷和穿心莲内酯配伍使用和单独使用同样能起到较强的全身抗炎作用。

另外,本研究通过耳肿胀试验、扭体试验、热板反应对小鼠模拟局部急性炎症反应,结果表明,雷公藤多苷或穿心莲内酯单独使用可显著抑制小鼠因二甲苯所致的耳肿胀率(P<0.05)。而雷公藤多苷和穿心莲内酯配伍使用时,可极显著地抑制小鼠因二甲苯所致的耳肿胀率(P<0.01)。可见雷公藤多苷和穿心莲内酯配伍使用可极显著地缓解小鼠因炎症所致的红、肿、热、痛,抗炎效果较雷公藤多苷和穿心莲内酯单独使用好。

肌酐(CRE)是人体对肌肉的代谢产物,其代谢排除主要依靠肾小球的滤过作用,其含量可反应肾小球的滤过功能,当肾脏受到损伤时,血液中肌酐的含量会显著提高[9];尿素氮(BUN)也通过肾小球滤过排出体外,当肾脏病变或受损时,血液中的尿素氮含量也会因代谢异常而提高[10]。谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)主要存在与肝细胞中,当肝脏受到损伤时,AST和ALT会释放到血液中,使其在血液中的含量升高[11]。本试验通过LPS诱导的小鼠全身炎症反应试验,检测出雷公藤多苷和穿心莲内酯配伍使用可以显著减少小鼠血液中因炎症而升高的肌酐、尿素氮、谷草转氨酶、谷丙转氨酶的含量,但与雷公藤多苷或穿心莲内酯单独使用的结果没有显著性差异,表明穿心莲内酯和雷公藤多苷配伍不能减弱雷公藤的毒性。

研究发现,雷公藤多苷和穿心莲内酯配伍使用与单独使用都具有较强的抗炎效果,且两者配伍使用效果更好,但两者单独使用和配伍使用的抗炎效果不具有显著性差异,无统计学意义。其次,与穿心莲内酯配伍后,雷公藤多苷的毒性并未减弱。因此,治疗炎症反应时,单独使用穿心莲内酯或雷公藤多苷即可。