高效液相色谱法测定茶叶酚酸化合物的含量

屈艳勤，Tukhvatshin Marat，郑德勇，张 钎，杨江帆，叶乃兴*

(1.福建农林大学园艺学院/茶学福建省高校重点实验室，福建 福州 350002；2.福建农林大学材料工程学院，福建 福州 350002)

茶叶是一种健康的饮品，受到越来越多人的喜爱。茶叶中含有丰富的内含物，主要有碳水化合物、茶多酚、氨基酸、咖啡碱、茶色素、茶多糖、有机酸、纤维素以及矿质元素等[1]，这些物质对人体的生理调节和保健具有重要的作用。有机酸作为茶叶中一种含量较少但却有重要作用的物质，近年来受到越来越多的关注和研究。有机酸是茶叶香气和滋味的主要成分之一，能够参与茶树新陈代谢，对茶叶的品质具有重要影响[2]。

茶叶中含有种类较多的有机酸，主要包括草酸、柠檬酸、抗坏血酸、酒石酸、苹果酸、没食子酸、水杨酸等。按照其分子结构不同，有机酸可分为简单一元羧酸如乙酸、丙酸、丁酸等；二元羧酸和多元羧酸，如苹果酸，柠檬酸等；酚酸类如：水杨酸、没食子酸、咖啡酸、阿魏酸等。目前对茶叶中有机酸的研究中，以二元羧酸和多元羧酸为主[3,5]，对茶叶中酚酸化合物的研究较少或比较单一。而茶叶中酚酸化合物因易发生氧化反应对茶叶的品质有重要的影响，如没食子酸，能够参与儿茶素的氧化形成茶黄素类物质；绿原酸是具有生物活性的天然防腐剂，具有抗菌、抑菌的作用[6]；咖啡酸和阿魏酸具有抗氧化、抗病毒、抑制癌细胞、降血脂等功能[7]；水杨酸是植物体内普遍存在的一种植物激素，参与并影响植物的多种代谢过程[8]。研究表明[9]，酚酸具有抗氧化、清除自由基、消炎、抗癌等保健功能，因此对茶叶中酚酸化合物的研究具有重要意义。

目前，酚酸化合物的检测方法主要有薄层色谱法[10-11]、气相色谱法[12]、气相色谱-质谱法[13]，高效液相色谱法[14-17]，液相色谱-质谱法[18]、毛细管电泳法[19]等。高效液相色谱法具有分析时间短、灵敏度高、操作方便、结果可靠等特点，因此是目前比较常用分析方法。高效液相色谱在测定酚酸化合物的过程中，也需要进行色谱条件优化，以确保多种酚酸化合物能够同时测定。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试茶样为福安大白茶鲜叶及其鲜叶按照不同茶类加工工艺制成的红茶、绿茶、白茶。

1.2 主要仪器与试剂

Agilent1200高效液相色谱仪，DAD检测器(型号G1315D)，自动进样器(型号G1329A)(美国Agilent公司)，TC-C18色谱柱(4.6×250 mm，5 μm，美国Agilent公司)；Sartorius 电子分析天平(瑞士赛多利斯)；纯水机(美国Millipore公司)；恒温水浴锅(常州国华电器有限公司)；GL-20G-II高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)；SL-250高速粉末机(浙江省永康市松青五金有限公司)；DHG-9203A型电热风干燥炉(上海精宏实验设备有限公司)。

乙腈(色谱纯)购自默克化工技术(上海)有限公司；乙酸(分析纯)购自国药集团化学试剂有限公司；水杨酸、肉桂酸、咖啡酸、阿魏酸、没食子酸、绿原酸、苯甲酸、对香豆酸(纯度均大于98%，用于高效液相色谱标准品)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；试验所有超纯水由Millipore纯水仪制备(美国Millipore公司)。

1.3 样品制备方法

茶叶样品加工时间为2018年4月12～17日，福安大白茶一芽三四叶鲜叶原料，按照不同茶类的加工工艺制作而成的红茶、绿茶、白茶。其加工工艺分别为：(1)白茶样品的加工方法：将鲜叶薄摊于竹筛上，在30℃下萎凋48 h，然后80℃烘至足干得成品茶。(2)绿茶样品的加工方法：将鲜叶投入150℃电炒锅中进行炒青，揉捻，120℃下干燥20 min，之后在80℃下烘至足干。(3)红茶样品的加工方法：将鲜叶置于竹筛上进行萎凋，揉捻，发酵4 h，在120℃下干燥20 min，之后在80 ℃下烘至足干[20]。茶鲜叶采用微波固样，固样时间为70 S，120℃下干燥20 min，之后在80℃下烘至足干。烘干鲜叶及成品茶用粉碎机粉碎，过40目筛，密封放置于-20℃冰箱中保存。准确称取粉碎茶样0.200 g(精确至0.001 g)置于15 mL聚四氟乙烯离心管中加入10 mL超纯水，置于70℃水浴中浸提20 min，冷却至室温后以7000 r·min-1的速度离心10 min，将上清液转移至10 mL容量瓶中定容至刻度，取待测液1 mL过0.45 μm滤膜，用于高效液相色谱测定。试验重复3次。

1.4 标准溶液的配置

分别准确称取各标准品10.0 mg，用水溶解并定容至10 mL，配制成质量浓度为1000 mg·L-1的单标储备液。准确移取各标准储备液1 mL，置于10 mL容量瓶中，配制成浓度为100 mg·L-1混合标准测试液，用水逐级稀释，配制成浓度范围为0.5～100 mg·L-1系列混合标准溶液，保存于4℃冰箱中备用。

1.5 色谱条件

色谱柱：TC-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱温：35℃；进样量：10.0 μL；流动相A相：0.1%(体积分数)乙酸水溶液，流动相B相：乙腈；流速：1.0 mL·min-1。梯度洗脱程序：0～30.0 min，8% B～30% B；30.0～40.0min，30% B～8% B；40.0～45.0 min，8% B。

2 结果与分析

2.1 色谱波长的选择

通过紫外吸收光谱图分析，同时比较8种酚酸化合物在328、280、270、254 nm不同波长下的吸收峰，结果显示在328 nm处，咖啡酸、绿原酸、对香豆酸、阿魏酸具有较高的灵敏度，而没食子酸、水杨酸、苯甲酸、肉桂酸灵敏度较低；在280 nm处，8种酚酸均具有较高的灵敏度，而在270 nm和254 nm处，部分目标物出现倒峰，试验结果见图1。因此，为实现多种酚酸化合物是同时测定，试验中选择280 nm作为检测波长。

图1 不同波长处8种酚酸标准品的色谱图Fig.1 Chromatograms of 8 phenolic acids at different wavelengths注：1没食子酸；2.绿原酸；3.咖啡酸；4.对香豆酸；5.阿魏酸；6.水杨酸；7.苯甲酸；8.肉桂酸。下同。

2.2 洗脱溶剂的选择

高效液相色谱法测定酚酸的方法有很多，试验过程中流动相的种类、pH条件对色谱峰的影响很大。酚酸测定常用的流动相有0.1%乙酸甲醇溶液-0.1%乙酸水溶液[21]；甲醇-0.1%甲酸水溶液[22]；0.1%甲酸-0.1%甲酸乙腈溶液[23]；乙腈- 10 mmol·L-1乙酸铵水溶液[24]等。试验过程中，考察甲醇-0.1%乙酸、乙腈-0.1%乙酸作为流动相时目标物的分离效果，通过梯度洗脱，结果表明以乙腈-0.1%乙酸水溶液作为流动相时，8种酚酸化合物能够有效分离且无严重拖尾现象，能够实现定量分析茶叶中酚酸化合物的目的。因此，试验过程选择乙腈-0.1%乙酸水溶液作为茶叶中酚酸化合物分离的流动相。结果如图2所示。

2.3 柱温的选择

色谱柱温度对目标物色谱峰的保留时间和分离具有一定的影响，柱温升高会加快传质过程，缩小分离度。本试验考察了不同柱温下(25、30、35、40、45、50℃)酚酸化合物的分离情况。试验结果如图3所示，结果表明，当柱温为35℃时，各目标物色谱峰之间分离情况较好。

2.4 标准曲线的建立

精密吸取系列混合标准品溶液各10 μL，按照试验方法中色谱优化条件进样分析，以各酚酸进样浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，得回归方程，结果见表1。8种酚酸混合标准溶液在浓度范围0.50～100 mg·L-1内，各组分的保留时间、标准曲线、线性范围、相关系数以及精密度。

图2 不同流动相下酚酸标准品的色谱图Fig.2 Chromatograms of phenolic acids standards under varied mobile phases

图3 不同柱温下8中酚酸化合物的保留时间Fig.3 Retention times of 8 phenolic acids under different column temperatures

结果表明各标准品在一定的浓度范围内具有良好的线性关系，相关系数均大于0.99。测定精密度0.80%～1.59%，表明精密度良好。

2.5 样品回收率测定

在样品中加入定量的混合标准溶液，按照2.1中样品制备方法进行提取，测定加标回收率，结果见表2。结果表明，8种酚酸化合物的加标回收率95.7%～118.2%，测得回收率良好。

表1 8种酚酸化合物的保留时间、浓度范围、标准曲线、相关系数以及精密度Table 1 Retention times, concentration ranges, standard curves, correlation coefficients, and accuracies of 8 phenolic acids

2.6 样品含量测定

按照样品制备方法和色谱条件，对茶样中酚酸化合物进行测定，所得色谱图与标准样品色谱图对比如图4所示。通过比对未知峰和已知酚酸化合物的保留时间以及光谱图，最终确定样品的各组分，根据线性回归方程计算各组分相应的含量，各组分含量分析结果见表3。

表2 8种酚酸化合物的回收率Table 2 Recovery rates on 8 phenolic acids by newly developed HPLC method

注：ND表示未检出

图4 酚酸化合物色谱图Fig.4 The chromatogram of phenolic acids注：a.标准样品；b.鲜叶茶样

表3 茶叶中酚酸化合物的含量Table 3 Recovery rates on 8 phenolic acids by newly developed HPLC method (单位：mg·g-1)

注：ND 表示未检出，每行不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

由表3可见，3类茶叶在加工过程中总酚酸化合物的含量都有所提高，总酚酸含量白茶最高(2.87 mg·g-1)，其次是红茶，绿茶中总酚酸含量最低。3类茶叶以及茶鲜叶中含量较高的是没食子酸，白茶中含量最高为2.41 mg·g-1，其次是水杨酸和绿原酸；对香豆酸、阿魏酸在茶叶中含量较低，且无显著性差异；咖啡酸在鲜叶、绿茶和白茶中有检出，且含量无显著性差异，在红茶中未测出，这可能是与红茶叶加工过程中的发酵有关；苯甲酸、肉桂酸在鲜叶以及3类茶叶中均未测出。8种酚酸化合物在茶鲜叶以及3类茶叶中的总含量为2.19～2.87 mg·g-1。

3 结论与讨论

试验建立一种高效液相色谱法测定茶叶中酚酸化合物的方法，该方法能够很好的将8种酚酸化合物进行分离，且测定精密度在0.80%～1.59%之间，重现性较好。回收率在95.7%～118.2%之间，回收率良好。该方法适用于茶叶中酚酸化合物的测定。通过测定8种酚酸化合物在红茶、绿茶、白茶的含量，结果表明，没食子酸在3类茶叶中含量最高，其次是水杨酸和绿原酸，且总酚酸含量在白茶中最高，绿茶中较低。该方法具有较高的灵敏度和较好的重现性，能够实现对红茶、绿茶、白茶三类茶样中酚酸化合物的同时检测，为茶叶加工过程中 其它理化成分的分析提供借鉴，也为以后研究其它酚酸化合物在茶叶加工过程中的变化提供参考。