标准化六味地黄胶囊药效学研究

石 菊，高 陆，许艳茹，曲笑锋，白 冰，李 敏，宫海全，徐 建

六味地黄是滋阴补肾之首方，用于治疗肾阴亏损、腰膝酸软等症［1-2］，按中医理论，这些疾病可归结为肾阴虚［3］.现代医学则认为肾阴虚与人体下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）、性腺（HPGA）轴以及免疫密切相关.因此，本研究深入探讨标准化六味地黄胶囊对肾阴虚大鼠血清中cAMP、cGMP、ACTH、Cor.、SOD、MDA，肾阴虚小鼠血清中IgG、IgM、廓清指数K、吞噬指数α和淋巴细胞增殖能力的影响［4-5］，并与六味地黄胶囊比较，为其临床应用提供理论依据.

1 材料

1.1 动物

ICR小鼠、Wistar大鼠，雄性，6周龄，体重：20±2 g，200±20 g，长春市亿斯实验动物技术有限责任公司，合格证号：SCXK（吉）2016-0003.

1.2 药品、试剂和仪器

（1）药品.标准化六味地黄胶囊，批号：171001，修正药业集团股份有限公司；六味地黄胶囊，批号：151001，修正药业集团股份有限公司；杞菊地黄胶囊，批号：160101，重庆赛诺生物药业股份有限公司.

（2）试剂.氢化可的松注射液，批号：151214，吉林省华牧动物保健品有限公司；免疫球蛋白IgM和IgG试剂盒，批号：201707；环磷酸腺苷（cAMP）、环鸟苷酸（cGMP）、睾酮（T）、促肾上腺皮质激素（ACTH）、皮质醇（Cor.）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD），批号：201708.

（3）仪器.SMP-500-18272-LSI0型酶标仪（Designed in California USA）；6100型 CO2培养箱，日本SANYAN公司；CDS-1型倒置显微镜，重庆光学仪器厂；AB204-E分析天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司.

2 方法

2.1 标准化六味地黄胶囊对肾阴虚大鼠下丘脑-垂体-肾上腺、性腺轴的影响的检测

（1）肾阴虚动物模型制备及分组［6］.雄性Wistar大鼠共100只，空白组大鼠腹腔注射生理盐水，每天25 mg·kg-1；其余大鼠腹腔注射氢化可的松，每天25 mg·kg-1，连续注射7 d后停药1 d，观察大鼠一般形态.凡出现双目无神、精神不振、屈背蜷缩、大便稀烂、肛温和肢端温降低、饮水量减少，与正常对照组有显著差异者为造模成功.随机分为空白组、模型组、标准化六味地黄胶囊高、中、低剂量组（216mg·kg-1、108mg·kg-1、54mg·kg-1）、六味地黄胶囊组（108 mg·kg-1）、杞菊地黄胶囊组（1 000 mg·kg-1），每组10只.造模成功后隔日开始药物干预，空白组和模型组，常规喂养，灌喂0.4%CMC溶液10 mg·kg-1，1次/天，连续给药14 d.

（2）指标检测.给药14 d后，以水合氯醛3 mL·kg-1，腹腔注射，腹主静脉取血，静置30 min后，3 500 r·min-1离心 15 min，测血清中cAMP、cGMP、T、ACTH、Cor.、MDA、SOD 含量；解剖动物，无菌取肾上腺、睾丸，称重并记录.

2.2 标准化六味地黄胶囊对糖皮质激素肾阴虚小鼠免疫功能的影响的检测［7-11］

（1）肾阴虚动物模型制备及分组.100只ICR小鼠分为空白组10只和造模组90只，造模组小鼠皮下注射氢化可的松1 mg/只，隔日1次，共3次；正常对照组，注射等量生理盐水，频率与模型组相同，第7 d造模组小鼠随机分为：模型组、标准化六味地黄胶囊高、中、低剂量组（400 mg·kg-1、240 mg·kg-1、80 mg·kg-1）、六味地黄胶囊组（240 mg·kg-1）、杞菊地黄胶囊组（2 100 mg·kg-1），连续给药7 d.

（2）对肾阴虚小鼠体液免疫指标测定.末次给药1 h后，各组小鼠眼球取血，3 500 r·min-1离心15 min，测血清中IgM和IgG含量.

（3）对肾阴虚小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响.末次给药后1h，称体重，各鼠均按0.1mL/10 g剂量由尾静脉注入印度墨汁（以生理盐水按1∶5稀释），注射后分别在1 min（t1）、10 min（t2）从小鼠眼眶静脉丛取血20 μL溶于2.0 mL 0.1%Na2CO3溶液中摇匀，放置20 min后在680 nm波长处测其吸光度值（A），以0.1%Na2CO3溶液作空白对照，将小鼠处死后取肝脏、脾脏和胸腺，称重，根据公式计算廓清指数K值和吞噬指数α值［12-13］.

式中：t1、t2分别为取血时间；A1、A2分别为在时间t1、t2时所取血样对应的吸光度.

（4）对肾阴虚小鼠T淋巴细胞增殖的影响.取小鼠脾脏，研磨，获取单个脾细胞，加至比重为1.08的淋巴细胞分离液上，2 000 r·min-1，20 min，密度梯度离心，吸取中间云雾状细胞层，用10%FBS RPMI-1640洗涤2次，1 000 rpm离心10min，然后用完全营养液配成5×106个/mL.取1 mL加入24孔细胞培养板内，加入终浓度为5 μg·mL-1的ConA，培养48 h后，每孔加入100 μL MTT溶液，再继续培养12 h.取出培养板，2 000 rpm离心5 min，弃去上清液，每孔加入DMSO 1 mL，于振荡器上充分振荡30 s.然后静止20 min，在560 nm波长处比色分析.利用公式计算刺激指数，判断淋巴细胞增殖情况［14］.

2.3 统计方法

实验数据利用SPSS13.0软件进行统计分析，组间比较采用成组设计定量资料的t检验.

3 结果

3.1 标准化六味地黄胶囊对肾阴虚大鼠下丘脑-垂体-肾上腺、性腺轴的影响

肾阴虚模型组大鼠出现烦躁、易激惹、拱背扎堆、毛发枯槁易脱落、大便干结、饮食增多等症状.与空白对照组比较，模型组血清cAMP、ACTH、Cor.、MDA含量升高（P＜0.05，P＜0.01），cGMP、T、SOD含量明显降低（P＜0.01，P＜0.001）.与模型组比较，标准化六味地黄胶囊高剂量组血清中cAMP、ACTH、Cor.、MDA含量降低（P＜0.05，P＜0.01），cGMP、T、SOD含量升高（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）；中剂量组血清中 cAMP、ACTH、Cor.、MDA含量有所降低（P＜0.05，P＜0.01），cGMP、T、SOD含量升高（P＜0.05，P＜0.001）；低剂量组血清中cGMP含量升高（P＜0.05），Cor.含量降低（P＜0.05）；杞菊地黄胶囊血清中cAMP、ACTH、Cor.、MDA含量降低（P＜0.05，P＜0.001），cGMP、T、SOD含量升高（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）.表明标准化六味地黄胶囊能抑制肾阴虚大鼠血清cAMP含量升高和cGMP含量下降，能明显减缓肾阴虚模型大鼠血清ACTH、Cor.浓度上升的趋势，使其血清T含量基本恢复到正常水平，调节机体生殖功能，降低自由基对细胞的伤害，调节机体抗氧化能力，标准化六味地黄胶囊中剂量作用优于六味地黄胶囊.结果见表1.

表1 标准化六味地黄胶囊对肾阴虚大鼠血清中cAMP、cGMP、ACTH、Cor.、T、SOD、MDA含量的影响（±s，n=10）

表1 标准化六味地黄胶囊对肾阴虚大鼠血清中cAMP、cGMP、ACTH、Cor.、T、SOD、MDA含量的影响（±s，n=10）

注：与空白组比较，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01，▲▲▲P ＜0.001；与模型组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01，***P ＜0.001，与标准化六味地黄胶囊中剂量比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01，△△△P ＜0.001.

组别 剂量/（mg·kg-1）cAMP/（nmol·L-1）cGMP/（nmol·L-1）ACTH/（pg·mL-1）Cort./（ng·mL-1）T/（pg·mL-1）SOD/（U·mL-1）MDA/（nmol·mL-1）1.79±0.10 2.64±0.53▲2.35±0.19△△△2.47±0.34△△△1.82±0.17***1.92±0.14**2.00±0.15**空白组模型组杞菊地黄胶囊组六味地黄胶囊组— —标准化六味地黄胶囊高剂量组中剂量组低剂量组1 000 108 216 108 54 5.14±0.69 7.09±1.07▲▲6.26±0.34*△△△6.49±0.43△△△5.29±0.31***5.35±0.31***5.44±0.40***8.18±0.51 6.85±1.49▲8.17±0.53*8.48±0.45**8.75±0.42**8.58±0.54**8.19±0.56*40.36±1.68 50.19±7.68▲▲▲44.59±2.03*45.29±2.03 43.04±5.38*44.29±2.24*47.29±3.26 77.07±2.98 99.23±30.48▲74.31±3.47*80.64±6.81 77.52±6.01*79.00±4.45*83.47±4.57 317.43±30.76 283.82±32.70▲319.88±13.93**321.16±19.25**346.44±22.40***340.19±75.72*300.60±28.62 5.18±1.06 4.08±0.98▲4.83±0.92 5.09±0.81*5.60±1.32*5.45±1.42*5.08±0.52*

3.2 标准化六味地黄胶囊对肾阴虚小鼠体液、细胞和非特异性免疫功能的影响

与空白组相比，模型组鼠血清中IgG和IgM含量有所升高（P＜0.05），胸腺指数、廓清指数K显著减小（P＜0.01，P＜0.001），吞噬指数α有所降低（P＜0.001），刺激指数显著降低；与模型组比较，标准化六味地黄胶囊高、中剂量组血清中IgG和IgM含量降低（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001），小鼠廓清指数K、吞噬指数α有所增加（P＜0.01，P＜0.001），T淋巴细胞刺激指数显著增加，分别为158.2%、126.4%，标准化六味地黄胶囊中剂量组与杞菊地黄胶囊作用相当，优于六味地黄胶囊.详见表2～表4.

表2 标准化六味地黄胶囊对肾阴虚小鼠血清中IgG和IgM含量的影响（±s，n=10）

注：与空白组比较，▲▲P ＜0.01，▲▲▲P ＜0.001；与模型组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01，***P ＜0.001.

IgM/（μg·mL-1）805.38±106.62 1 262.80±344.38▲▲946.59±195.95*846.94±246.26**808.19±95.13***822.41±221.07**995.73±120.24*组别空白组模型组杞菊地黄胶囊组六味地黄胶囊组剂量/（mg·kg-1）— —标准化六味地黄胶囊高剂量组中剂量组低剂量组2 100 240 400 240 80 IgG/（mg·mL-1）10.36±0.97 14.35±1.41▲▲▲10.91±1.28***10.99±1.07***10.59±1.23***10.75±0.68***10.93±2.07***

表3 标准化六味地黄胶囊对肾阴虚小鼠脏器/体质量比值的影响（±s，n=10）

表3 标准化六味地黄胶囊对肾阴虚小鼠脏器/体质量比值的影响（±s，n=10）

注：与空白组比较，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01，▲▲▲P ＜0.001；与模型组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01，***P ＜0.001，与标准化六味地黄胶囊中剂量比较，△△P ＜0.01.

吞噬指数/α 6.68±1.32 4.31±1.03▲▲▲6.42±1.08***5.70±1.52*6.26±1.05***6.12±0.47***4.39±3.03组别空白组模型组杞菊地黄胶囊组六味地黄胶囊组标准化六味地黄胶囊剂量/（mg·kg-1）— —高剂量组中剂量组低剂量组2 100 240 400 240 80脾脏指数/（mg·g-1）5.5±1.32 8.85±4.75▲4.09±1.49**6.52±2.36 6.54±1.81 7.23±2.37 7.41±1.81胸腺指数/（mg·g-1）2.61±0.67 1.29±0.27▲▲▲1.81±0.19***△△2.03±0.79*2.70±0.58***2.50±0.65***2.12±0.82**廓清指数/K 0.069±0.02 0.039±0.01▲▲0.059±0.02*0.055±0.03 0.061±0.02**0.056±0.01**0.037±0.03

表4 标准化六味地黄胶囊对肾阴虚小鼠淋巴细胞增殖能力的影响（±s，n=10）

表4 标准化六味地黄胶囊对肾阴虚小鼠淋巴细胞增殖能力的影响（±s，n=10）

组别空白组模型组杞菊地黄胶囊组六味地黄胶囊组标准化六味地黄胶囊剂量/（mg·kg-1）— —高剂量组中剂量组低剂量组2 100 240 400 240 80刺激指数/%100 23.7 126.0 97.1 138.2 124.6 85.2

4 讨论

现在市场销售不同厂家的六味地黄胶囊，其治疗效果也是良莠不齐，根据《国家中医药管理局办公室 国家发展改革委办公厅关于做好中药标准化项目管理工作的通知》（国中医药办科技发［2017］4号），已将修正六味地黄胶囊列入中药重点产品标准化建设品种之一［15］，通过对六味地黄胶囊生产工艺验证、规程制定与SOP修订，建立六味地黄胶囊生产内控质量标准体系，使得六味地黄胶囊产品标准化，本研究采用糖皮质激素肾阴虚动物模型，对标准化六味地黄胶囊与六味地黄胶囊的滋阴补肾作用作对比研究，制定六味地黄胶囊生产规范和行业质量标准化，以保证六味地黄胶囊临床效应的一致性.

HPA轴是由下丘脑、垂体与肾上腺构成的调节人体多种生命活动的重要神经内分泌功能轴之一，HPA轴紊乱下丘脑分泌大量CRH，促使垂体分泌ACTH增加，进而刺激肾上腺皮质释放GCS，使血清CORT水平明显升高.结果表明，模型小鼠垂体ACTH和血清Cor.水平确实明显升高.以氢化可的松注射液灌胃建立肾阴虚大鼠模型，模型组大鼠出现神经内分泌免疫功能紊乱，以血清中cAMP含量明显升高、cGMP含量明显降低表明模型建立成功，而各给药组能抑制肾阴虚大鼠血清cAMP含量升高和cGMP含量下降，使其血清cAMP、cGMP含量基本恢复到正常水平，不同程度地提高了ATCH、Cort.的含量，改善HPA轴功能紊乱.与空白组比较，模型组肾上腺皮质变薄，球状带、束状带变窄、结构不清，细胞排列不规则，体积缩小，细胞质呈空泡状，细胞间隙变宽，局部有坏死及炎性细胞；标准化六味地黄胶囊、杞菊地黄胶囊球状带、束状带、网状带结构清晰，细胞排列有序，偶见炎性细胞，其中以标准化六味地黄胶囊组织形态最接近空白组.HPGA轴是神经-内分泌-免疫网络的重要组成部分［16］.结果表明，外源性给予糖皮质激素可以在HPGA轴的多个环节对其产生抑制作用［17-19］，标准化六味地黄胶囊对肾阴虚大鼠受损性腺（睾丸、子宫）有修复作用，并能上调雄鼠血清T水平，说明标准化六味地黄胶囊对HPGA轴功能紊乱有靶向调节作用.由于糖皮质激素水平的升高诱导了胸腺细胞的凋亡，结果表明，标准化六味地黄胶囊对肾阴虚小鼠的体液免疫、细胞免疫及非特异性免疫有明显的调节作用.即能促进机体生成抗体，增强T细胞的增殖和腹腔巨噬细胞的吞噬功能.能在较短的时间内使肾阴虚小鼠的免疫功能恢复到基本正常水平，调节神经免疫内分泌系统，使免疫的病理状态趋于正常，且作用优于六味地黄胶囊.