苍耳子炮制前后植物蛋白含量的比较研究

武子敬，徐佳新，李明达，朱成光

苍耳子（Fructus xanthii）为菊科植物，味甘，温，有小毒，归肺经，具有散寒通窍祛湿的功效，用于治疗风疹头痛，鼻塞流涕，鼻鼾等，为鼻渊头痛之要药［1］.植物蛋白有多种药理作用，如抗氧化活性、抗菌活性，还具有一定免疫活性等［2］.苍耳子有小毒，其植物蛋白又是其毒性成分之一，本实验以苍耳子中植物蛋白作为研究内容，考察炮制前后植物蛋白含量变化，以便为苍耳子在临床应用方面提供依据，现将研究结果报告如下.

1 实验仪器与材料

1.1 试药

中药材：购于通化市医药大厦的苍耳子药材.

试剂：考马斯亮蓝G-250（购自国药集团化学试剂有限公司）；牛血清蛋白对照品（批号：20180808）；乙醇（天津市致远化学试剂有限公司）；氯化钠（天津市致远化学试剂有限公司）；磷酸（天津市致远化学试剂有限公司）；硝酸（天津市致远化学试剂有限公司）.

1.2 仪器

可控调温电炉（郫县永信电器厂）；BCD-265（KG28EV2S0C）型冰箱（博西华家用电器有限公司）；电子天平（深圳市无限量衡器有限公司经销）；分光光度仪（北京普析通用仪器有限责任公司）；玻璃试管；高速多功能粉碎机（永康市天祺盛世工贸有限公司）.

2 方法与结果

2.1 制备炮制品

生品：取原药材5 g，除去杂质，用时粉碎.

炒品：取净苍耳子5g置炒制容器内，用中火加热翻炒至黄褐色，刺焦时即可取出，碾去刺筛净.

2.2 定性鉴别

（1）硝化反应.分别取蛋白质对照品溶液和加入苍耳子炮制品粉末的样品溶液5 mL放置于试管里，加入2 mL浓硝酸后，静置5 min，观察二者的颜色变化，结果显示，加入苍耳子的样品溶液呈棕黄色，蛋白质对照品呈现黄色，基本保持一致，说明其苍耳子中含有蛋白质.另取一支试管，加入5 mL纯化水，同样加入2 mL浓硝酸，静置5 min观察颜色变化，结果显现白色，无明显变化.

（2）色谱鉴别.阳性对照：取浓度为10 mg·L-1蛋白质对照品溶液5 mL，加入双缩脲试剂5 mL，震荡均匀后显现紫色；供试品溶液：取5 g苍耳子样品置试管中，并向5 g苍耳子的样品的试管中加入纯化水10 mL，超声过滤收集滤液水，滤液浓缩5 mL，加入双缩脲试剂5 mL，震荡均匀，显现紫色；阴性样品溶液：取纯化水5 mL，加入双缩脲试剂5 mL，震荡均匀，呈浅蓝色.此外，需要取这3种染色液，相应试剂为空白，在紫外分光光度仪400～700 nm波长处扫描，均有最大吸收峰位于540 nm处，阴性样品溶液在该波长范围内无最大吸收.

2.3 定量检测

（1）溶液的制备［3-4］.

①精密称取0.438 g NaCl溶于50 mL容量瓶中，再加纯化水，定容前检查装置是否漏水，然后倒转和摇动的方法使瓶内液体混合，配好0.15 mol·L-1NaCl的溶液.

②取考马斯亮蓝G-250 50 mg，放入烧杯，加入25 mL乙醇，50 mL磷酸，注意要混匀，然后加入纯化水，慢慢将其稀释至500 mL，所制得的溶液为考马斯亮蓝G-250的染色液，以备实验所用.

③选用电子天平称取牛血清蛋白25 mg，放于25 mL容量瓶中，用纯化水溶解后，定容，即得，放于4℃下放置在冰箱中保存.取该溶液0.2 mL，加0.15 mol·L-1NaCl溶液到2 mL，再加考马斯亮蓝G-250溶液10.0 mL，混合均匀后，大约放5 min，得到蛋白质对照品溶液.

④取苍耳子炮制品粉末0.1g，加入0.15mol·L-1NaCl溶液到2 mL，此处一定要记得利用超声波进行溶解，加入考马斯亮蓝10.0 mL，混合均匀，放置大约5 min，等待反应.

⑤取2 mL的0.15 mol·L-1NaCl溶液，10.0 mL考马斯亮蓝G-250溶液，混合，放置一段时间，待其充分反应，得到的是空白样品溶液.

（2）测定波长的选择.上述配制的5种溶液，除了0.15 mol·L-1NaCl溶液和考马斯亮蓝G-250溶液，其余三种分别放置于紫外分光光度仪上扫描，设定一个固定波长围为500～700 nm，记录蛋白质对照品和样品溶液在595 nm处有最大吸收，即设定波长为595nm，如图1～图3.

图1 蛋白质对照品溶液紫外吸收谱

图2 样品溶液紫外吸收谱

图3 空白样品溶液紫外吸收谱

（3）曲线方程的建立.分别精密称取蛋白质对照品储备液 0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL放置于10 mL试管中，每管加0.15 mol·L-1的NaCl溶液至1.0 mL，混和均匀.分别取0.1 mL上述各个试管中的溶液放置于试管中，加入考马斯亮蓝G-250溶液染色液5.0 mL放置一段时间，即得到相应毫升中所含蛋白质含量.分别放于595 nm处测定吸光度值，读取5次，取其平均值，浓度值为横坐标，吸收度为纵坐标，曲线方程：Y=0.284X+0.569 8（r=0.997 2），标准蛋白质溶液3.62～18.25 mg·mL-1呈良好线性关系.

（4）精密度试验.分别取蛋白质对照品和空白样品溶液，在595 nm波长处测定吸光度值数次，重复多次，才会使结果更加接近准确，算得结果RSD为1.24%，表明仪器精密度良好.

（5）稳定性试验.主要考察所要测的蛋白质在一段时间内是否稳定，那么取经过染色后的蛋白质对照品溶液，595 nm波长处测定吸光度值，但是要分别放置30 min、60 min、120 min、180 min、360 min，结果算得RSD为1.86%，表明供试品溶液在360 min内稳定.

（6）重复性试验.取苍耳子炮制品粉末0.1 g，加入0.15 mol·L-1NaCl溶液到2 mL，此处一定要记得利用超声波进行溶解，加入考马斯亮蓝G-250溶液10.0 mL，混合均匀，放置大约5 min，等待反应充分得样品溶液.取该溶液5份，595 nm处测定吸光度，计算出样品含量，算得结果为RSD为1.43%.表明此方法重复性良好.

（7）回收率试验.多次称取固定含量的苍耳子炮制品1 g放置于试管中，分组编号，然后按样品含量的不同百分比，如60%、90%、120%加入蛋白质对照品溶液.加入0.15 mol·L-1NaCl溶液到2 mL，利用超声波进行溶解，加入考马斯亮蓝G-250溶液10.0 mL，混合均匀，放置大约5 min，等待反应充分得样品溶液，再取空白溶液于相同波长处测吸光度值，计算含量，得回收率为95.4%，表明该方法准确度较高.

（8）含量测定.精密吸取苍耳子炮制品粉末0.1 g放置于试管中，各3份，按照最开始的方法制备样品溶液，同样要取空白样品溶液595 nm处测定吸光度值，见表1.

表1 样品含量表（±s，n=3）

表1 样品含量表（±s，n=3）

RSD/%1.21 1.34样品炒制苍耳子生品苍耳子样品含量1.02 1.04

本实验研究表明，炮制前后的苍耳子中植物蛋白的含量有所变化，炮制后的苍耳子中植物蛋白的含量的变少.

3 讨论与结论

考马斯亮蓝法的检测原理是基于染料考马斯蓝G250和蛋白质之间形成的特异性结合，是最常用的测蛋白质含量的方法中比较不受干扰的一种［4］.而双缩脲试剂是目前首先推荐的蛋白质定量方法，其原理是蛋白质分子中的肽键在碱性条件下与二价铜离子（Cu2+）作用生成蓝紫色的化合物，这种颜色反应强度在一定浓度范围内与蛋白质含量成正比，经与同样处理的蛋白标准液比较，即可求得蛋白质含量［3］.

利用双缩脲试剂、考马斯亮蓝法能快速测得植物蛋白中的含量.本实验研究表明，炮制前后的苍耳子中植物蛋白的含量有所变化，炮制后的苍耳子中植物蛋白的含量变少，而苍耳子毒蛋白为其毒性成分之一［5］，其现代炮制方法有净制、炒制，苍耳子药用必须炒焦黄，由于加热炮制后脂肪中蛋白变性，而不被溶解，达到减毒的目的，盛昌翠［6］、张婷婷［7］通过实验均发现苍耳子炒制品毒性较生品降低，本实验研究首次从植物蛋白的角度考察苍耳子的炮制意义，为苍耳子的开发和利用提供了更好的依据.同时，可以从植物蛋白的角度重新审视中药炮制在中药发展的重要作用，也为中药炮制品的发展提供新的研究思路.