针刺治疗大鼠酒精戒断焦虑征的作用机制

邢宇双，林娜，梁启超，杨志*，吴宜艳*

(1.齐齐哈尔医学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006；2.牡丹江医学院，黑龙江 牡丹江 157011)

酒精依赖不仅损害个人健康，更是家庭暴力和犯罪的重要根源。焦虑和抑郁等为代表的酒精戒断征是酒精依赖的主要负性强化效应，是酒精成瘾者复饮乃至严重依赖的重要诱因，因此缓解和防止酒精戒断焦虑征一直被视为治疗酒精依赖的最有效手段之一[1]。

针刺作为中医的两大支柱之一，具有疗效稳固，操作安全简单和无成瘾性等优点，自古以来被广泛用于成瘾药物的脱敏和脱毒治疗。近30年以Bullock等人为代表的一些国内外学者们通过随机对照临床实验证明了针刺疗法对酒精依赖的治疗效果，并观察到针刺人体一些特定穴位显著减轻了酒精依赖者对酒精的渴望程度，同时明显减少了他们的饮酒次数和饮酒量，为针刺疗法在酒精依赖中的应用提供了强有力的临床支持[2]。2005年，Kim等人报告了针刺足三里和三阴交穴位调节大脑纹状体和伏隔核多巴胺神经的兴奋性，抑制大鼠过度运动，肌肉僵硬和震颤等酒精戒断机体症状的实验结果[3]。最近几年针刺治疗酒精戒断焦虑征的研究尤其受到我国学者们的重视，2010年,张雅红等人在国家自然基金项目资助下，完成了电针治疗改善酒精依赖住院患者情绪的研究[4]。

在焦虑样症状的产生以及表达中，机体常伴随着CRH-ACTH-肾上腺内分泌反应轴的功能亢进。促肾上腺皮质激素释放(Corticotropin releasing hormone，CRH)调节内分泌、自主神经、中枢神经和行为反应，是机体应答应激刺激的重要神经肽。第二信使环磷酸腺苷(Cyclic adenosine monophosphate，cAMP)的效应元件作为顺势增强子位于CRH基因的上游调节区，与其转录活性密切相关。由此我们假设：酒精戒断过程中，cAMP和CRH的浓度上升终产生焦虑。中医学认为，焦虑症之神志不安多由脏腑功能失调、气机失常所致, 涉及到心、肝、脾以及肾。足三里为足阳明胃经合穴，三阴交，足三阴经的交会穴，起到疏肝调肝、健脾化痰、补虚培元，对治疗焦虑症状具有非常重要的作用。综上所述，本实验欲在动物实验水平观察和证明针刺三阴交、足三里对大鼠酒精戒断焦虑样症状的治疗作用，探究其作用机制，为针刺疗法防治酒精复饮提供实验和理论依据。

1 实验材料

1.1 实验动物

SPF级雄性SD大鼠，体质量220～250 g。哈尔滨医科大学动物实验中心提供，质量合格证号：23001700000704。实验动物饲养在SPF级实验室，温度(22.0±2.0)℃，食物和水供应充足。

1.2 主要实验试剂

cAMP酶联免疫检测试剂盒：南京建成生物工程研究所；CRH酶联免疫检测试剂盒：南京建成生物工程研究所。

1.3 实验仪器

针刺针(华佗牌)：广州得源医疗器械有限公司； 电针仪(BT701-1B)：上海华谊医用仪器有限公司； 旋涡混合器(XH-D)：上海比朗仪器有限公司；高架十字迷宫：上海欣软信息科技有限公司；恒温培养箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；酶标仪(M3)：MolecularDevices。

2 实验方法

2.1 实验动物分组、酒精成瘾模型的建立及治疗

选取健康SD大鼠54只，随机分为空白组(生理盐水)，模型组(20%Eth)，电针两穴组(20%Eth+电针单侧足三里、三阴交)，针刺两穴组(20%Eth+针刺单侧足三里、三阴交)，三阴交组(20%Eth+针刺单侧三阴交)，足三里组(20%Eth+针刺单侧足三里)。除空白组外，其余5组每天腹腔内注射20%(w/v)酒精1.5 mL/100 g，共28 d，制备酒精成瘾模型[5]，撤酒精3 d，制备酒精戒断焦虑征模型，撤酒精期间分别针刺相应的穴位进行治疗，治疗前先将大鼠固定在自制的绑鼠台上，用酒精进行消毒，电针两穴组进行治疗时，针刺单侧足三里、三阴交，针柄接上电针仪，选用疏密波，频率为15/25 Hz，电流为1～2 mA，刺激的强度以大鼠被针刺侧的下肢轻微颤抖为度。每天进行1次，每次针刺30 min，连续治疗3 d，空白组和模型组在相同的时间进行与针刺组相同的固定，但不进行针刺治疗。

2.2 行为学指标测试

实验室内光线昏暗并保持恒亮，室温24℃，保持安静。将每只大鼠置于高空十字架(EPM)的正中央释放，每只大鼠测试时间为5 min。每一只动物完成测试后，清理粪便，并对装置用酒精进行彻底清洁消毒。

测试指标：进入到开放臂次数(OE)：即进入到任一开放臂的次数，以大鼠4个爪均进入到臂内开始，中途有1个爪从该臂中完全撤出，视为该次进入活动完成；进入到开放臂时间(OT)：进入到开放臂停留的时间，单位：秒(s)；进入到闭合臂次数(CE)：即进入到任一闭合臂的次数，以大鼠4个爪均进入到臂内开始，中途有1个爪从该臂中完全撤出，视为该次进入活动完成；进入到闭合臂时间(CT)，进入到闭合臂停留的时间，单位：秒(s)。由以上指标分别计算出：①进开放臂次数比例OE%=OE/(OE+CE)×100%；②开放臂停留时间比例OT%=OT/(OT+CT)×100%

2.3 ELISA测CRH、cAMP浓度

所有大鼠都完成高架十字迷宫(EPM)测试后，立即将每只大鼠断头处死，剪开颅盖和脑膜，剥离组织后，将大脑放在冰盘上，迅速取出左右两侧海马，称重后，立刻放入-80℃的液氮中保存，之后转移到-80℃低温冰箱里存放。将试剂盒在室温下平衡半小时。配置标准品稀释液，浓度分别为480、240、120、60、30 nmol/L。取海马，匀浆，离心，取上清，待测。空白孔不加样，只加显色剂A、B和终止液用于调零；标准品孔，每孔加入稀释好的标准品50 μL，零孔加入标准品/样品稀释液50 μL，然后加入辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)试剂50 μL；样品孔，加入样品50 μL，然后加入HRP试剂50 μL。轻轻摇晃，盖上封板膜，37℃培养箱中孵育60 min。洗涤5次，拍干。在每个孔内先加入显色剂A 50 μL，随后加入显色剂B 50 μL，轻轻震荡以混匀，37℃下避光显色，显色10 min。每孔加终止液50 μL，终止反应。以空白孔调零，450 nm波长依序测量各孔的吸光值(OD值)。测定在加入终止液后的10 min内进行。

2.4 统计学方法

3 实验结果

3.1 针刺治疗对大鼠OE%和OT%的影响

在高架十字迷宫测试中，与空白对照组相比，酒精戒断大鼠在开放臂的逗留次数和时间明显减少；与模型组相比，电针两穴治疗后可显著增加在开放臂停留的次数、时间，针刺两穴组能增加其逗留次数，而单穴位治疗组作用效果不明显。结果见表1。

表1 针刺对EPM大鼠进入开放臂次数比(OE%)、开放臂停留时间比(OT%)的影响

注：与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型对照组相比，#P<0.05，##P<0.01

3.2 ELISA 检测cAMP结果比较

与空白组相比较，酒精成瘾大鼠海马中cAMP的浓度明显升高，与模型组相比，电针两穴组和针刺两穴组能显著的降低cAMP的浓度，单穴位治疗组降低cAMP的趋势不明显。结果见表2。

表2 针刺对酒精戒断大鼠cAMP浓度的影响

注：与空白组相比，*P<0.05，**P<0.01；与模型组相比，#P<0.05，##P<0.01

3.3 ELISA检测CRH结果比较

与空白组相比，酒精成瘾大鼠的海马中CRH的浓度显著升高，与模型组相比较，电针两穴组与针刺两穴组经治疗可明显降低海马中CRH的浓度，三阴交组和足三里组降低CRH浓度的趋势不明显。结果见表3。

表3 针刺对酒精戒断大鼠CRH浓度的影响

注：与空白组相比，*P<0.05，**P<0.01；与模型组相比，#P<0.05，##P<0.01

4 讨论

焦虑征大多是因为脏腑功能失调、气机失常而导致神志不安，足三里是足阳明胃经合穴，三阴交是肝、肾、脾经的交会穴，这两个穴位既能调节所属脏腑的经气，同时又针对了焦虑征的病理特点进行治疗。近年来，三阴交、足三里作为治疗焦虑征的主要穴位，受到广大学者的关注。有实验证明，电针三阴交可缓解自然更年期大鼠的焦虑行为[6]，针刺足三里可减轻海洛因戒断后所产生的焦虑症状，且疗效稳定[7]。本实验中，我们选取了三阴交和足三里进行针刺治疗，观察到通过同时针刺这两个穴位可明显缓解酒精戒断所产生的焦虑症状，由此我们猜测针刺这两个穴位可能存在相互作用而使治疗效果得到加强。单穴位的治疗效果并未如相关文献中所了解的那么显著，这可能是由于针刺的天数和时长不同所导致。电针疗法是应用电针仪输出脉冲电流，通过毫针作用于经络穴位以达到治疗疾病目的的一种方法，它将毫针的刺激和电生理的效应相结合，这种方法不仅可以提高针刺的治疗效果，同时还增加了针刺的治疗范围，加强了针刺疏通经络的作用[8]。有文献报道[9]，电针治疗焦虑征的效果与抗焦虑药物的治疗效果相当，且避免了药物所带来的依赖性等副作用。在本研究中，多项实验结果也证实了电针疗法较普通针刺确有更好的疗效。

大量的研究结果显示，当机体受到内外环境的刺激时，应激反应会表现出一系列的神经内分泌物质的变化，主要表现为HPA轴的兴奋。下丘脑室旁核是HPA-神经内分泌轴的中枢位点，CRH则是HPA轴激活的关键性物质。适量的CRH的增多可使机体处于兴奋的状态，但CRH的含量过高时，则可引起适应性的机制障碍，进而引发多种症状的发生，其中包括焦虑、抑郁等。有研究表明，在应激刺激下，CRH的浓度以及CRH mRNA的表达均显著增加[10]。在焦虑症状中所观察到的激素含量的变化主要是由CRH的过度分泌所导致[11]。新近研究表明，CRH的受体拮抗剂可作为抗焦虑以及抗抑郁的神经药理学治疗方法[12]。由本实验结果我们也观察到，酒精戒断焦虑征大鼠的海马中CRH的浓度较空白组大鼠均增加，经针刺治疗后，其数值又下降至正常水平，由此证实了，CRH在焦虑的发生中占有重要的地位。

焦虑征受多种基因和多种环境因素的调控，目前发现其可能通过一系列的信号转导级联反应进行调控。有研究表明，与G蛋白相偶联的cAMP信号传导通路的异常与焦虑密切相关，这一论证从我们的实验结果中得到了证实，酒精戒断大鼠的cAMP的浓度升高，针刺治疗后得到缓解。cAMP是体内比较重要的第二信使，它对多种神经递质的功能发挥起调节作用。近年来，有大量的研究结果证实，cAMP依赖的PKA信号通路在酒精依赖的形成过程中具有重要的作用。环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)作为PKA重要的下游信号蛋白，在药物的成瘾中也起着尤为重要的作用，因此，近年，CREB在酒精成瘾的相关研究中成为又一备受关注的研究热点。CREB 通过结合 cAMP效应元件(CRE)调节基因的转录，CRE是在各种基因调节区域中的顺式增强子，CRH基因的上游调节区中存在CRE序列，而且已经证实，CRE的功能与CRH的转录活性密切相关，由此为我们的实验结果提供证据：针刺抗焦虑的作用可能通过调节cAMP-CRH相互作用，终使酒精戒断焦虑征得到缓解。同时由本实验结果证实了cAMP、CRH之间可能确存在某种联系，共同调节酒精戒断焦虑征的发生。

综上所述，本实验探究了针刺可缓解酒精戒断期间的焦虑样行为，初步证实针刺可能通过cAMP-CRH相互作用来缓解酒精戒断焦虑样症状，为针刺疗法开发成为防治酒精复饮的有效治疗手段提供实验和理论依据，也为综合利用中医疗法治疗其他毒品成瘾提供强有力的实验支持。