水解蛋白替代鱼粉对大菱鲆生长及生理代谢的影响

姜立生，陈 玮，李宝山，孙永智，王际英，黄炳山，王世信

（山东省海洋资源与环境研究院，山东省海洋生态修复重点实验室，烟台 264006）

水解蛋白是利用现代生物学技术将传统蛋白原料进行水解而获得的，因其中含有大量的小肽，易于消化吸收，水解蛋白原料也逐渐被应用于水产饲料中［1-2］。研究表明：低鱼粉饲料中添加5.5%水解鱼蛋白［3］或 10%磷虾水解物［4］可以提高大菱鲆（Scophthalmus maximus）对饲料氨基酸的利用，12.5%的羽毛水解物替代饲料中76%的鱼粉不影响欧洲舌齿鲈（Dicentrarchus labrax）的生长［5］，饲料中添加3%～5%的酵母水解物能有效改善凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）生长性能、提高饲料利用率、促进消化吸收以及改善肠道形态学指标［6］，水解豆粕部分替代鱼粉可提高星斑川鲽（Platichthys stellatus）幼鱼的生长性能和饲料利用效率［7］。此外，也有研究表明，不同来源的水解蛋白对花鲈（Lateolabrax japonicus）的生长及体成分的影响也不相同［8］。目前关于水解蛋白替代鱼粉的研究主要集中在生长性能、血清生化指标及肠道健康等方面，且在大多数的报道中水解蛋白的适宜添加量较低。水解蛋白中的小肽分为营养性小肽和功能性小肽，营养性小肽可降低机体吸收时的能耗，促进摄食，显著促进生长；功能性小肽影响机体生理代谢，进而影响营养素的利用；此外，水解蛋白中含有某些生理活性物质，在机体内可执行多种生理功能［2］。饲料中添加水解蛋白势必会对实验动物的代谢生理、尤其是内分泌生理产生影响。

大豆浓缩蛋白（soybean protein concentrated）因其粗蛋白含量与鱼粉相当、且氨基酸组成相对平衡，而被广泛应用于渔用饲料中。研究表明：大豆浓缩蛋白可以替代大黄鱼（Larimichthys crocea）［9］配合饲料中20%及75%的鱼粉。而刘兴旺等［10］研究表明大豆浓缩蛋白会对大菱鲆饲料的适口性产生影响，从而不适宜应用于大菱鲆配合饲料中。因此，本研究分别用水解鱼粉和水解大豆浓缩蛋白全部替代饲料中的鱼粉蛋白，研究对大菱鲆生长及代谢生理的影响，以期为水解蛋白在水产配合饲料中的应用研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验饲料与制作

以鱼粉和大豆浓缩蛋白为蛋白源，鱼油为脂肪源，设计粗蛋白含量为50%、粗脂肪含量为10%的基础饲料配方。分别以水解鱼粉（99%＜3 000 Da）和水解大豆浓缩蛋白（36% ＜3 000 Da）替代饲料中的鱼粉，制作3组等氮等能的实验饲料，分别命名为 FM（fishmeal）、HF（hydrolyzed fishmeal）、HS（hydrolyzed soybean meal）组，实验饲料组成及基本成分见表1，实验所用的鱼粉、水解鱼粉及水解大豆浓缩蛋白基本成分及氨基酸组成见表2。水解鱼粉及水解大豆浓缩蛋白为本实验室酶解制作，制作流程见文献［7］。饲料制作时各固体原料（过60目标准筛）采用逐级混匀法混匀后，加入新鲜鱼油和蒸馏水，再次混匀后用小型饲料挤压机制成直径分别为3 mm和5 mm的颗粒，60℃烘干后，-20℃保存备用。

1.2 实验管理

养殖实验在山东省海洋资源与环境研究院循环水养殖系统中进行。实验用鱼购自山东省蓬莱宗哲养殖有限公司。实验开始前，将500尾大菱鲆幼鱼放养于系统中，使其适应养殖环境。2周后挑选规格整齐、健康体壮的鱼180尾，平均体质量（58.50±0.65）g。实验分为3个饲料组，每个饲料组3个平行。将实验用鱼平均置于9个绿色养殖水桶中（直径70 cm，水深45 cm），每个桶20尾鱼，日投喂 2次（8∶00、16∶00），饱食投喂，初始日投喂量为鱼体质量的1.5%，投喂30 min后，从系统自带的收集装置排出残饵，数颗粒计算残饵量，养殖实验持续56 d。实验期间水质条件为：水温（18±0.5）℃，溶氧 ＞5 mg·L-1，非离子氨和亚硝酸氮含量均＜0.01 mg·L-1，盐度28～30。

表1 实验饲料配方及其基本营养成分Tab．1 Formulation and approximate composition of experimental diet （%）

表2 饲料蛋白原料基本成分及氨基酸组成Tab．2 Composition and amino acids profiles of diet protein ingredients （%）

1.3 样品采集与测定

养殖实验结束后，实验用鱼饥饿24 h，用MS-222（30 mg·L-1）麻醉后，称鱼体质量、计数量，计算增重率及成活率。每组随机取10尾鱼，逐尾称重后，用无菌注射器尾静脉取血，血液置于4℃冰箱内4 h后，3 000 r·min-1离心，分离血清。取血后的鱼置于冰盘上解剖，分离肌肉、内脏，然后从内脏团中分离出肝胰脏、肠道、脾脏，分别称重并测量肠道长度，用于计算脏体比、肝体比、肠体比、脾体比及肠长比。肌肉及血清样品均保存于-80℃冰箱中，待测。

生长及形体指标：

增重率（weight gain rate，WGR，%）＝100×（Wf-Wi）／Wi；

特定 生 长 率 （specific growth rate，SGR，%·d-1）＝100×（ln Wf-ln Wi）／56；

饲料系数（feed conversion ratio，FCR）＝FI／WG；

日摄食率（daily feeds intake，DFI，%）＝100×FI／［（Wi+Wf）／2×56］；

蛋白质效率（protein efficiency ratio，PER，%）＝100×WG／（FI×CP）；

成活率（survive rate，SR，%）＝100×Ns／20；

脏体比（viseraosomatic index，VSI，%）＝100×WV／WB；

肝体比（hepatosomatic index，HSI，%）＝100×WH／WB；

肠体比（ratio of intestine weight to body weight，ISI，%）＝100×WI／WB；

脾体比（ratio of spleen weight to body weight，SSI，%）＝100×WS／WB；

肠长比（ratio of intestine length to body length，IBR，%）＝100×LI／LB；

式中：Wf为均末体质量（g）；Wi为均初体质量（g）；FI为摄食量（g）；WG为实验用鱼的增重量；CP为饲料中粗蛋白含量（%）；Ns为存活尾数；WV为内脏团质量（g），WB为体质量（g）；WH为肝胰脏质量（g）；WI为肠道质量（g）；WS为脾脏质量（g）；LI为肠道长度；LB为体长（cm）。

基本营养成分：

水分采用105℃恒重法测定（GB／T6435-2006），粗蛋白采用杜马斯燃烧法测定（Leco FP528，USA），粗脂肪采用索氏抽提法测定（GB／T6433-2006），粗灰分采用灰化法测定（GB／T6438-2007），能量采用氧弹仪燃烧法测定（Parr 6100，USA）［7］。

血清生化指标测定：

血清中谷丙转氨酶（alanine amino transferase，ALT）、谷草转氨酶（asparate amino transferase，AST）、总蛋白（total protein，TP）、白蛋白（albumin，ALB）、甘油三酯（triglyceride，TG）、总胆固醇（total cholesterol，TCHO）、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）采用全自动生化分析仪测定（Hitachi7020，Japan），试剂购自北京利德曼生化股份有限公司。

血清生理指标测定：

血清中生长激素（growth hormone，GH）、皮质 醇 （cortisol， COS）、去 甲 肾 上 腺 素（noradrenaline，NE）、三碘甲状腺原氨酸（three iodine thyroid，T3）、补体3（complement 3，C3）、免疫球蛋白 M（immunoglobulin M，IgM）、丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）、己糖激酶（hexokinase，HK）采用Elisa试剂盒测定（上海酶联生物科技有限公司）测定，测定方法及活力单位设定见文献［7］。

1.4 数据处理

实验所得数据采用Microsoft Excel 2007和SPSS17.0软件进行单因素方差分析（One-way ANOVA），差异显著时（P＜0.05），采用 Duncan氏检验进行多重比较分析。统计结果以平均值±标准差（Means±SD）的形式表示。

2 结果与分析

2.1 水解蛋白替代鱼粉对大菱鲆幼鱼生长及形体指标的影响

由表3可见，水解鱼粉和水解大豆浓缩蛋白替代鱼粉，均显著降低了试验鱼的增重率、特定生长率和蛋白质效率（P＜0.05），提高了饲料系数（P＜0.05），但是对成活率无显著性影响（P＞0.05）。水解鱼粉组试验鱼的生长性能及饲料利用效率显著高于水解大豆浓缩蛋白组（P＜0.05）。

2018年11月8日下午3时，随着汽笛声传来，由白俄罗斯开往重庆的第三趟传化乳制品直达班列顺利抵达团结村中心站。该班列由41个集装箱组成，满载白俄罗斯优质乳制品，全程8000多公里，历时12天。这是继今年首趟重庆直达白俄罗斯班列开通后双方的再一次深入合作，也是白俄罗斯到中国的首个整装班列，当天举行了隆重的接车活动。

水解鱼粉和水解大豆浓缩蛋白替代鱼粉后，对试验鱼的脏体比、肝体比、肠体比、肠长比均无显著影响（P＞0.05），但降低了脾体比（P＜0.05）。水解大豆浓缩蛋白组试验鱼肥满度显著高于其他组（P＜0.05）

2.2 水解蛋白替代鱼粉对大菱鲆幼鱼肌肉基本成分的影响

由表5可见，水解鱼粉和水解大豆浓缩蛋白替代鱼粉后显著提高了试验鱼肌肉中水分含量（P＜0.05），降低了粗蛋白含量（P＜0.05），但是对粗脂肪及粗灰分含量无显著影响（P＞0.05）。

表3 水解蛋白对大菱鲆幼鱼生长的影响Tab．3 Effects of dietary hydro-protein on growth performance of S．maximus juveniles

2.3 水解蛋白替代鱼粉对大菱鲆幼鱼血清生化指标的影响

由表6可见，水解鱼粉和水解大豆浓缩蛋白替代鱼粉后，试验鱼血清中谷丙转氨酶及谷草转氨酶的活力有显著升高（P＜0.05），总蛋白、白蛋白、甘油三酯、总胆固醇及高密度脂蛋白胆固醇含量均有了显著降低（P＜0.05）。3组鱼血清中低密度脂蛋白胆固醇含量无显著差异（P＞0.05）。目前关于大菱鲆血清生化指标的报道相对较多，本实验中所测得指标均在参考范围之内。

表4 水解蛋白对大菱鲆幼鱼形体指标的影响Tab．4 Effects of dietary hydro-protein on figure index of S．maximus juveniles

表5 水解蛋白对大菱鲆幼鱼肌肉基本成分的影响Tab．5 Effects of dietary hydro-protein on muscle compositions of S．maximus juveniles（%wet weight）

表6 水解蛋白对大菱鲆幼鱼血清生化指标的影响Tab．6 Effects of dietary hydro-protein on biochemical indices of serum of S．maximus juveniles

2.4 水解蛋白替代鱼粉对大菱鲆幼鱼血清生理指标的影响

由表7可见，水解鱼粉及水解大豆浓缩蛋白替代鱼粉后，试验鱼血清中生长激素、三碘甲状腺原氨酸含量及己糖激酶活力均无显著变化（P＞0.05）；水解鱼粉组皮质醇含量显著高于其他两组（P＜0.05），补体3含量显著低于其他两组（P＜0.05），其他两组之间无显著差异（P＞0.05）；水解大豆浓缩蛋白组去甲肾上腺素含量显著低于其他两组（P＜0.05），其他两组之间无显著差异（P＞0.05）；水解大豆浓缩蛋白组免疫球蛋白M含量显著高于鱼粉组（P＜0.05），水解鱼粉组与其他二组均无显著差异（P＞0.05）；鱼粉组丙酮酸激酶活力显著高于大豆浓缩蛋白组（P＜0.05），显著低于水解鱼粉组（P＜0.05）。

3 讨论

3.1 水解蛋白替代鱼粉对大菱鲆幼鱼生长、形体指标及体成分的影响

本实验中，水解蛋白完全替代鱼粉后，试验鱼的生长性能和饲料利用效率均有了显著降低，这与其他研究者的报道较为一致［5-7］。目前关于水解蛋白的研究报道中，水解蛋白替代鱼粉适宜比例为15%～76%，且在鱼饲料中的替代量显著高于虾，过量添加则对实验动物的生长有抑制作用［5，21］。但从本实验结果来看，不同的蛋白水解物对实验动物影响并不一致，水解鱼粉蛋白的完全替代效果显著优于水解大豆浓缩蛋白。蛋白质水解后会产生低分子量的肽，可以促进动物的摄食并降低消化吸收及合成过程中的能耗［22］，因此低浓度添加时，可以促进动物的生长；当饲料中低分子量肽含量过高时，会影响其他结构氨基酸的吸收，破坏蛋白质的氨基酸平衡，导致氨基酸氧化，从而降低动物的生长［23］。

目前，有研究报道水解蛋白对实验动物的促生长作用与其中小肽的生物活性有关［24］。但蛋白质水解产生的小肽的结构和功能存在较大差异［25］，在水解过程中是否失活，穿越肠道屏障后是否存在生理活性［26］等均存在不确定性。本实验中水解鱼粉的替代效果优于水解大豆浓缩蛋白，这与它们的水解度及氨基酸组成（水解大豆浓缩蛋白中蛋氨酸和赖氨酸含量较低）存在较大差异有关［1］，这也是造成二者之间生长存在差异的原因之一。因此，在水解蛋白的使用中，仍需进一步研究以确定其中的功能性或营养性成分的种类及含量。

水解蛋白的使用效果与水解蛋白的添加比例、来源及水解度有密切关系［3，21，27］。在相当多的研究报道中，水解蛋白替代鱼粉对试验鱼的脏体比、肝体比、肌肉基本成分含量均无显著影响［8，28］，本实验结果与之较为一致。本实验中，水解蛋白替代鱼粉提高了肌肉中水分含量，间接降低了大菱鲆肌肉粗蛋白含量（粗蛋白含量占干物质的比例并没有显著变化），与对珍珠龙胆石斑鱼（Epinephelus fuscoguttatus♀ ×E.lanceolatus♂）的研究结果一致［21］。

表7 水解蛋白对大菱鲆幼鱼血清生理指标的影响Tab．7 Effects of dietary hydro-protein on physiological indices of serum of S．maximus juveniles

3.2 水解蛋白替代鱼粉对大菱鲆幼鱼血清生化生理指标的影响

血清中谷丙转氨酶和谷草转氨酶是评价机体肝脏功能的重要指标，虽然本实验所测得酶活力在参考范围之内，但水解蛋白替代鱼粉显著提高了二者的活力，表明水解蛋白给试验鱼肝脏造成了损伤［29］，且水解大豆浓缩蛋白对肝脏的损伤高于水解鱼粉。从本实验的结果分析，水解蛋白引起大菱鲆肝脏损伤的原因可能与水解蛋白的水解度有关［23］，也与水解蛋白中氨基酸和实验动物有关［6-7］。

血清总蛋白和白蛋白含量也是肝脏功能的重要指标之一，与机体的营养状况密切相关［23］。本研究中，水解蛋白替代鱼粉降低了试验鱼血清中总蛋白和白蛋白含量，这与在黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）［30］中的研究结果一致，但对草鱼（Ctenoparyngodon idellus）［31］的研究表明，血清蛋白不受饲料组成的影响，这可能与饲料中蛋白质的形式有关。水解蛋白中含有丰富的小分子肽，其吸收与结构氨基酸不同步，从而降低了血清中蛋白含量。

血脂指标的变化反应了机体脂肪代谢的变化，血脂中的主要成分是甘油三酯和胆固醇，其中甘油三酯参与能量代谢，胆固醇则主要用于合成细胞浆膜、类固醇激素和胆汁酸。在已有的报道中，饲料中添加水解蛋白，影响了黄颡鱼［30］、花鲈［8］、星斑川鲽［7］的血脂指标，但对黄颡鱼［28］、褐牙鲆（Paralichthys olivaceus）［32］的血脂指标均无影响。

本实验所测的血清生理指标包含了激素、免疫及糖代谢3个方面，且摄食不同蛋白源对各方面的影响不尽相同。本研究中，不同蛋白原料对试验鱼的生长激素和三碘甲状腺原氨酸含量均无显著影响，但显著影响了皮质醇和去甲肾上腺素的含量，表明水解蛋白对试验鱼造成了胁迫，但水解鱼粉和水解大豆浓缩蛋白对鱼体造成胁迫的原因是不同的。补体3和免疫球蛋白M是鱼体免疫能力的重要评价指标，其中补体3是抵抗微生物感染的重要物质，免疫球蛋白M具有强大的杀菌、激活补体、免疫调理和凝集作用。本实验中，水解鱼粉降低了试验鱼补体C3的含量，而水解大豆浓缩蛋白提高了免疫球蛋白M的含量，表明二者影响鱼体免疫能力机理的不同。己糖激酶和丙酮酸激酶是生物体糖代谢过程中的关键酶，其中己糖激酶专一性差、Km值低、易饱和，活力较难发生变化［33］；丙酮酸激酶活力的变化表明机体对糖利用能力的差异，也反应了机体供氧能力的差异。研究表明，饲料糖来源及含量［34］、环境胁迫［35］均能影响鱼体丙酮酸激酶的活力。本实验中不同饲料蛋白源对丙酮酸激酶活力的影响差异较大，这反应了不同蛋白源中功能性物质的差异。