黑猩猩肠道菌群高通量测序分析
2019-10-25
(杭州动物园，浙江 杭州 310008)
随着社会的进步与发展，动物园的职能发生了转变，动物种群管理与建设变得日益重要，杭州动物园内现有7只成年黑猩猩(Pantroglodytes)，保护和壮大现有黑猩猩种群已成为工作的重点。黑猩猩与人同属人科，是现存与人类亲缘关系最近的动物，碱基对序列排列上98.77%部分完全相同。
肠道菌群是生存在机体肠道内的微生物群，种类多，数量大，与机体的食物消化、营养吸收、能量代谢、免疫应答等生理活动密切相关[1]。国内肠道菌群研究主要对象为家禽家畜，也有部分为珍稀动物，包括川金丝猴、大熊猫以及虎等[2-6]，尚未有对黑猩猩肠道菌群的多样性分析。本试验采用高通量测序技术对黑猩猩肠道菌群的多样性进行分析，希望能在维持肠道菌群平衡、保证动物健康方面提供参考。
1 材料与方法
1.1试验动物 杭州动物园饲养的7只成年黑猩猩，编号1-7：1号20岁雌性，2号12岁雌性，3号10岁雄性，4号9岁雄性，5号9岁雌性，6号8岁雄性，7号8岁雌性。采样前后食物谱、饲养条件一致，各黑猩猩身体健康。
1.2样品处理、数据分析 粪样采集前一天晚上7只黑猩猩单笼饲养，于早上8点取样，挑取少量新鲜粪便于已消毒的采样管中，7个粪样立即于-40 ℃冰箱保存。委托上海派森诺生物科技股份有限公司对样品进行前处理、Illumina Miseq高通量测序及数据分析，测序片段为16S rDNA V3～V4可变区。主要利用FLASH软件(v1.2.7，http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/)，QIIME软件(Quantitative Insights Into Microbial Ecology，v1.8.0，http://qiime.org/)对测序序列进行处理和统计分析。
2 结果与分析
2.1有效序列与不同分类地位OTU数 表1中7个样品测序获得有效序列40622-55923条，从门到种的OTU(操作分类单元)数为1473-2145，1412-2082，1406-2076，1080-1768，425-1079，175-548，各样品间波动较大，个体间差异明显。7号样品有效序列和各分类地位OTU均最少，门、纲、目、科水平OTU最高为5号样品，有效序列最多为1号样品，属、种水平OTU最多的为1号样品，有效序列量也最多。有效序列与各水平OTU有一定关联性。
表1 有效序列与不同分类地位OTU数
2.2菌群微生物多样性分析 从图1可以看出，稀释曲线随着测序深度增加逐渐上升，并趋于平缓，说明测序结果能够反映当前样本所包含的多样性。Shannon和Simpson为多样性指数，Shannon和Simpson值越大，说明群落多样性越高[7-9]。Chao1和ACE为丰富度估计指数，指数越大，表明群落的丰富度越高[10-11]。各样本的多样性指数见表2，Shannon值在7.09-8.52之间，Simpson值在0.938380-0.987122之间，Chao1值在1475.00-2658.01之间，ACE值在1475.35-2682.28之间。7号样品Simpson，Chao1和ACE值均为最小，分别为0.938380，1475.00和1475.35，Shannon值最小的为6号样品，5号样品的各指数值均最高，表明5号样品的肠道菌群丰富度和多样性最高，与有效序列和各水平OTU结果一致。
注：横坐标为样本抽取的有效序列数，纵坐标为OTU数目。图1 稀释曲线
样品SimpsonChao1ACEShannon10.9579042248.222456.297.4020.9601082220.302386.697.2830.9690271753.001753.007.8740.9800091666.001667.117.9050.9871222658.012682.288.5260.9432662147.362217.667.0970.9383801475.001475.357.21
2.3门属分类水平微生物组成分析
2.3.1门水平的微生物类群 所有样品共含有14个菌门，平均含量前五的菌门为拟杆菌门(39.5%)，厚壁菌门(36.7%)，变形菌门(0.6%)，WPS-2(7.4%)，螺旋体(3.5%)，除2号和5号样品的最优势菌群为厚壁菌门，其余个体均为拟杆菌门。2号和5号样品没有纤维杆菌门，仅3号，5号和6号样品没有互养菌门， 7号样品仅有TM7， 4号和6号样品仅有迷踪菌门，除这四种菌门外其它均为共有，含量各异。
图2 门水平的微生物类群组成
2.3.2属水平的微生物类群 7个样品中平均含量前七的菌属为普氏菌属(24.6%)，未分类瘤胃菌属(12.6%)，琥珀酸弧菌属(8.6%)，未分类WPS-2(7.4%)，未分类拟杆菌属(4.9%)，未分类梭菌属(4.9%)，未分类BS11(4.3%)，未分类的菌属占比很大。2号样品的最优势菌属为未分类拟杆菌属(18.4%)，7号样品的最优势菌属为未分类 BS11 (29.9%)，其它样品的最优势菌属均为普氏菌属(23.6-34.3%)。
注：仅标注平均含量前七属，共有102个属较多不好标注。图3 属水平的微生物类群组成
2.4基于UniFrac距离的样本聚类分析 各样品的聚类分析见图4，样品间的分枝长度越短，两样本越相似，3和6号样品相似度最高，其次为4和5号，2和7号，但3和6号，2和7号的多样性指数相差较大，4和5号序列量、OTU数相差较大。
图4 基于Unweighted UniFrac距离矩阵的UPGMA聚类分析图
3 讨论
7个样品测序获得有效序列40622-55923条，从门到种的OTU数为1473-2145，1412-2082，1406-2076，1080-1768，425-1079，175-548，多样性指数Shannon值在7.09-8.52之间，Simpson值在0.938380-0.987122之间，Chao1值在1475.00-2658.01之间，ACE值在1475.35-2682.28之间，各样品间波动较大，个体间差异明显。样品共含有14个菌门，11个菌门为共有，3个非共有菌门在各样品中的含量各异，除2号和5号样品的最优势菌门为厚壁菌门，其余个体均为拟杆菌门，2号和7号样品的最优势菌属分别为未分类拟杆菌属、未分类 BS11，其它样品的最优势菌属均为普氏菌属。聚类分析也体现出肠道菌群相似性中有差异性，引起差异性的原因可能是个体特异性，性别和年龄[12]，其差异性也体现了肠道菌群的复杂性。
