连续流动分析仪与自动凯氏定氮仪测定土壤全氮含量比较

宋书会，张金尧，汪 洪

［中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，国家化肥质量监督检验中心（北京），农业农村部农产品质量安全肥料源性因子风险评估实验室（北京），北京 100081］

氮是植物生长需求的主要营养元素，土壤氮主要包括有机氮和无机氮两种主要形态，是评价土壤供氮能力的指标，无机氮主要包括NO2-、NO3-、可交换态NH4+和被黏土固定的不可交换态NH4+，有机氮主要存在于土壤有机质、植物残体中，有机氮和无机氮通过固定、矿化作用相互转化［1］。在土壤科学、植物营养学、生物化学等领域对土壤营养供应、植物营养吸收等的研究均需测定土壤全氮含量［2］。

土壤全氮含量的测定主要为湿烧法和干烧法。凯氏定氮法为湿烧法，是传统的土壤全氮含量测定方法，主要包括蒸馏和滴定，首先用硫酸消煮土壤样品，将有机氮转化为无机氮以NH4+的形式存在，之后再测定消煮液中的铵。此方法之后被不断改进，主要为催化剂的使用和NH4+-N的测定，在消煮过程中可用K2SO4、CuSO4、Se、TiO2等作为催化剂加速氧化［3］，缩短消煮时间；消煮液中铵的测定方法主要包括蒸馏滴定法、扩散法和比色法［4］。NH4+的蒸馏和滴定是最常见的方法，即向消煮液中加入碱溶液，NH4+以NH3的形式挥发出被标准酸吸收，之后用标准酸液反向滴定。然而每个消煮的待测液需要15 min完成蒸馏-滴定过程，耗费时间较长［5］，即使采用自动定氮仪，蒸馏完成一个样品也需5 min左右［6］。靛酚蓝比色法也可用来测定消煮液中的NH4+，即碱性条件（pH值13.0左右）下铵和次氯酸根反应生成氯胺，用硝普钠催化，氯胺与水杨酸反应形成蓝绿色化合物，在波长660 nm处比色测定［7］，此过程较为简单，不需要较大的空间和特殊的实验设备［8］。

连续流动分光光度法测定NH4+-N主要根据靛酚蓝反应的原理，连续流动分析技术测定植物中全氮含量的结果与传统蒸馏滴定法的结果没有较大差异，连续流动分析方法测试速度较快，样品交叉污染小，广泛应用于农业、食品、环境监测等领域［9-12］。土壤全氮采用凯氏法消煮，连续流动分析仪测定还缺乏相应的研究，自动凯氏定氮仪测定结果与连续流动分析仪测定结果之间关系还不甚清楚。选择50个土壤样品和2个标准土壤样品用凯氏法消煮，连续流动分析仪测定消煮液中的NH4+，结果与自动凯氏定氮仪测定结果相比较，以探讨连续流动分析仪-靛酚蓝比色法，测定凯氏消煮液中NH4+含量方法的可行性。

1 材料与方法

1.1 土壤样品

农田采集的土壤样品于干净通风的室内自然风干，过0.149 mm筛［13］。土壤标准物质为河南黄潮土GBW07413a（ASA-2a）和江西红壤GBW07416a（ASA-5a）。

1.2 样品消煮

称取过0.149 mm筛的土壤样品1.000 g于100 mL消煮管中，加入2.0 g催化剂（K2SO4∶CuSO4∶Se=100∶10∶1，混合均匀，磨细过0.149 mm筛）和5 mL浓硫酸，摇匀，置于自动消解系统上加热，升温速度5℃/min，升温至200℃，保持30 min，继续加热至340℃，直至消煮液澄清，继续加热1 h。冷却至室温，去离子水定容至100 mL，摇匀以备分析测试。

1.3 自动凯氏定氮仪测定消煮液中NH4+-N

1.3.1 仪器设备

自动凯氏定氮仪的蒸馏仪型号：KjelFlexK-360，配置自动滴定仪型号：DL15，滴定管体积20 mL，分辨率1/10 000，电极DG115-SC，电位分辨率0.1 mV。

1.3.2 蒸馏滴定过程

1.3.2.1 试剂配置 （1）40% 氢氧化钠：溶解40.0 g 氢氧化钠于100 mL去离子水中；（2）20 g/L 硼酸：称取20.0 g 硼酸，溶于适量水中，定容至1 000 mL；（3）0.02 mol/L（1/2 H2SO4）：去离子水稀释2.83 mL H2SO4到 5 L；（4）0.01 mol/L（1/2 H2SO4）：将0.02 mol/L（1/2 H2SO4）（即配置3）准确稀释2倍，并用硼砂溶液标定之。方法如下：准确称取硼砂Na2B4O7·10H2O 1.907 1 g，溶于蒸馏水中，转移定容至1 L容量瓶，摇匀，即为0.01 mol/L的标准溶液。吸取3份该溶液各25.00 mL于3个三角瓶中，以甲基红做指示剂，以上述标准硫酸滴定至红色终点，分别记录消耗体积，计算0.01 mol/L（1/2 H2SO4）标准溶液浓度。

1.3.2.2 参数设置 准确移取20.00 mL消煮液转移至自动凯氏定氮仪专用蒸馏管中，打开自动凯氏定氮仪和配套的自动滴定仪开关，打开冷凝用自来水阀，将滴定仪上pH电极插入定氮仪接收瓶中。选择仪器“预先准备程序”，进行样品测定方法编辑，设定主要参数：加入40%氢氧化钠溶液30 mL、20 g/L硼酸接收液（pH值4.65）20 mL、蒸汽力度100%、反应时间5 s、蒸馏时间250 s、蒸馏结束后自动启动滴定，编辑完毕后保存，按定氮仪上启动开始键，开始自动蒸馏滴定。仪器测定之前，选择“清洗程序”，安装干净的空样品管，清洗仪器3次，仪器空白值相差＜0.05 mL开始测定。

1.4 连续流动分析仪测定消煮液中NH4+-N

1.4.1 仪器设备

连续流动分析仪，配置有MT7化学模块、操作软件AACE，图1为AA3连续流动分析仪结构示意图［14］。主要组成部分：进样系统、蠕动泵、化学分析模块、比色系统。

图1 AA3连续流动分析仪结构图

1.4.2 操作过程及分析条件

1.4.2.1 试剂配制 （1）缓冲液：称取35.8 g 磷酸二氢钠，32.0 g氢氧化钠，50.0 g酒石酸钾钠于600 mL水中，定容至1 000 mL；（2）水杨酸钠溶液：40.0 g水杨酸钠溶于600 mL蒸馏水，加入1.0 g硝普钠，稀释至1 000 mL，混均存放于棕色试剂瓶中；（3）次氯酸钠溶液：将3.0 mL次氯酸钠溶液（有效氯含量8%～10%）加入于60 mL蒸馏水中，稀释至100 mL，混合均匀，现用现配；（4）4% 硫酸溶液：移取40.0 mL浓硫酸稀释至1 000 mL；（5）硫酸铵储备液（N 1 000 mg/L）：准确称取4.717 g硫酸铵（120℃烘干2 h）溶于600 mL蒸馏水中，搅拌溶解，混合均匀，定容至1 000 mL。

1.4.2.2 参数设置 选择防酸进样针和高浓度进样管，设置进样速率50个样/h，进样与清洗比为2.0∶1，进样时间48 s，清洗时间24 s。仪器默认设置基线和漂移校正，自动基线参比为5%；比色滤光片波长为660 nm，灯强度大于l 000 mV。样品消煮液中含氮量在连续流动分析仪线性测量范围（＜N 50 mg/L）内，无需稀释。

1.4.2.3 标准曲线制作 移取10.0 mL硫酸铵储备液（即试剂配制5），定容至100 mL，混合均匀，即浓度为100 mg/L的NH4+-N标准溶液，分别吸取0.00、5.00、10.00、15.00、20.00、25.00 mL的NH4+-N标准溶液于50 mL容量瓶，用4%硫酸定容至50.0 mL。即NH4

+-N浓度为0.00、10.00、20.00、30.00、40.00、50.00 mg/L的NH4+-N系列标准溶液，按照上述连续流动分析仪条件进行测定，仪器测定峰高与标准溶液NH4+-N浓度之间进行线性回归，制作标准曲线如图2所示，其中 r2=0.999。

图2 连续流动分析仪测定NH4+-N标准曲线

1.5 统计分析和实验设计

测量值Xi的算术平均值为样品全氮估计值，标准偏差用贝塞尔公式计算［15-16］：

相对标准偏差（RSD%）=标准偏差/计算结果算术平均值×100；

分别采用连续流动分析仪和自动凯氏定氮仪测定50个样品和2个国家土壤标准物质全氮含量，两测定结果之间做相关回归分析。2个国家土壤标准物质和3个土壤样品分别用凯氏法消煮7次，连续流动分析仪测定消煮液中NH4+-N含量，以评估连续流动分析仪测定凯氏消煮液中NH4+-N含量的准确度和精密度。

2 结果与分析

2.1 土壤全氮

连续流动分析仪和自动凯氏定氮仪对50个土壤样品的测定结果见图3。连续流动分析仪测定的土壤全氮范围为0.68～2.06 g/kg，自动凯氏定氮仪测定的全氮范围为0.71～1.95 g/kg。

图3 连续流动分析仪和自动凯氏定氮仪测定土壤全氮含量

对连续流动分析仪和自动凯氏定氮仪测定土壤全氮含量进行相关性分析，由图4可知，回归方程为y（连续流动分析仪-NH4+-N）=0.995 1x（自动凯氏定氮仪-NH4+-N）+ 0.003 5，相关系数r=0.980（n=50，P＜0.01），斜率为 0.995 1 ，接近于 1。

图4 连续流动分析仪法和自动凯氏定氮仪法结果相关分析

2.2 配对样品t检验

表1显示，连续流动分析仪与自动凯氏定氮仪测定土壤全氮平均值均为1.07 g/kg，标准偏差分别为 0.219、0.215，相关系数 r为 0.980，且P＜0.01，两测定结果之间极显著相关；t检验结果表明，双尾检验P＞0.05，两种方法测定全氮含量没有明显差异，呈极显著线性相关。

表 1 配对样品t检验

2.3 连续流动分析仪测定准确度

同上述连续流动分析仪测试条件，两个标准土（河南黄潮土和江西红壤）凯氏法消煮、连续流动分析仪测定消煮液中NH4+-N含量，每个样品重复消煮7次，评估连续流动分析仪测定全氮结果的准确度（表2）。结果显示，连续流动分析仪测得两个标准土相对标准偏差分别为1.67%和3.09%，河南黄潮土氮含量为0.76 g/kg，在标准土确认值（0.77±0.03）g/kg范围内；江西红壤氮含量测定值为0.54 g/kg，介于江西红壤氮含量标准确认值（0.54±0.04）g/kg之间。因此，土壤全氮凯氏法消煮-连续流动分析仪测定NH4+-N含量方法准确度较高。

表2 连续流动分析仪测定土壤标准物质全氮含量

2.4 连续流动分析仪测定精密度

3个土壤样品凯氏法消煮7个重复，连续流动分析仪测定消煮液中NH4+-N含量，结果显示测定结果的相对标准偏差在1.19%～1.46%之间，均小于5%（表3）。连续流动分析仪测定土壤全氮精密度较好。

表3 连续流动分析仪重复测定样品全氮含量

2.5 连续流动分析仪测定方法检出限

重复测定20个试剂空白实验，图5为试剂空白测定结果。计算试剂空白测定结果的标准偏差，三倍空白标准偏差［17］作为检出限估计值，即检出限MLD=3×SD，得到本测定方法检出限的N质量浓度为0.128 mg/L。

图5 连续流动分析仪测定空白信号值

3 讨论

与传统的全自动蒸馏滴定法相比，连续流动分析仪包括自动进样系统、蠕动泵、化学分析模块、比色系统和数据处理系统，能够实现自动进样、自动分析检测［18］。连续流动分析仪测定土壤全氮过程中，消煮液、缓冲液、水杨酸钠、次氯酸钠进样量分别为0.23、0.80（单管）、0.23、0.23 mL/min。图1显示，缓冲液的最大需求量为1.60 mL/min。考虑到每天8 h工作时间和其他因素，上述试剂每天用量分别为110.4、768.0、110.4、110.4 mL，连续流动分析仪测定土壤全氮所用试剂量远小于自动蒸馏滴定技术。试剂配制和仪器调试约需要2 h，按照进样速率50个/h，一天可以测定300样次［6］。连续流动分析仪测定NH4+-N节省时间和人力，效率较高。

95%置信区间成对样品T检验结果显示，连续流动分析仪测定土壤全氮和凯氏法测定土壤全氮含量一致。Junsomboon等［19］研究流动注射系统（FIC法）测定牛奶、鸡蛋和肉制品中凯氏氮含量，结果显示FIC法测得结果和凯氏法测得结果之间具有极显著线性相关，且方法检出限为1 mg/L。本实验中连续流动分析仪测定NH4+-N与自动凯氏定氮仪测定NH4+-N结果间具有显著线性相关，回归方程为y（连续流动分析仪-NH4+-N）=0.995 1x（自动凯氏定氮仪-NH4+-N）+0.003 5 ，相关系数r=0.980，连续流动分析仪测定NH4+-N检出限为0.128 mg/L。连续流动分析仪测定土壤全氮的相对标准偏差均小于5%，精密度较高，且测定值均介于标准确认值范围内，测试结果较为准确。

4 结论

连续流动分析仪测定土壤全氮能够克服传统方法的缺点，相对标准偏差在5%以下，与全自动凯氏蒸馏滴定法测定结果间无明显差异，连续流动分析仪测定结果的准确度、精确度均较高。鉴于连续流动分析仪法具有节省人力、节约试剂、提高工作效率等优点，可适用于大批量土壤全氮含量的分析测定。