畜禽粪便堆肥快速升温除臭多功能复合菌剂及其应用

徐 杰，许修宏，门梦琪，行国瑞，谷 猛，杨 阳，杨荣艺，边鑫雨

（东北农业大学资源与环境学院，黑龙江 哈尔滨 150030）

畜禽养殖业作为农业重要组成部分，其粪便面源污染问题已成为关注焦点［1］。目前，我国畜禽粪便年排放量超40亿t，是工业有机污染物的4.1倍［2］，畜禽粪便产生的化学需氧量（COD）远超工业废水和生活污水COD总和［3］，粪肥投入导致土壤Olsen-P增量为等量化肥的3倍［4-5］。可见，如管理、利用不善，畜禽粪便将成为威胁环境的主要污染源［6］。利用畜禽粪便堆肥是资源化利用废弃有机物的理想途径［7-8］，但仍存在许多问题，如堆肥过程中的氨气挥发，造成空气污染同时降低肥效，堆体升温慢，导致纤维素等有机大分子降解不充分而延长堆肥腐熟时间等［9-11］。通常采用向堆肥中加入特定功能微生物的方法来干预控制氨挥发，提高堆肥氮素含量，促使堆体快速升温，加快有机质降解，从而加速堆肥腐熟进程、提高堆肥产品品质［12-14］。本试验采用多种筛选方法相结合，从土壤、秸秆、堆肥等不同来源样品中分离得到4株同时具有使堆肥快速升温和有效除臭潜力的纤维素降解菌株。将该4株菌株与本试验保藏的1株氨氧化细菌BM62（新型耐热芽孢杆菌）按照不同比例配制成复合菌剂，并进行堆肥功能验证，为将其应用于大规模堆肥生产提供基础理论依据和实践指导。

1 材料与方法

1.1 筛菌样品来源及功能菌株筛选

1.1.1 功能菌株的富集和初筛

首先称取5 g样品（土壤、秸秆、堆肥）加入到45 mL无菌水中，放入到恒温振荡器中振荡30 min，取菌悬液10 mL，加入150 mL牛肉膏蛋白胨培养液中，在30℃、150 r/min的恒温摇床培养箱中富集培养2～3 d。取富集后的菌悬液用稀释平板法进行划线分离纯化，最后选择48 h内长势良好、菌落较大的菌株进入复筛。

1.1.2 纤维素降解菌的复筛

将初筛纯化的菌株接种于羧甲基纤维素钠（CMC-Na）平板培养基上，30℃恒温箱中培养2～3 d，然后用质量浓度为1 g/L的刚果红溶液染色0.5 h，之后弃去染液，用浓度为1 mol/L的NaCl溶液脱色0.5 h，选取透明圈和菌落直径比（D/d）值大的菌株进行升温除臭菌的复筛。

1.1.3 升温菌、除臭菌的复筛

将秸秆剪成3～5 cm的小段，然后按照1∶3的质量比与鸡粪混合均匀，调节含水量为60%，即轻轻握住时，指缝间有水滴析出，不成股流下为宜。将其放入到33 cm×17 cm的聚丙烯袋中，每袋接种分离菌株10 mL种子液，每个菌株做3个重复。使用未接种的空白袋作为对照，并在室温下培养1至7 d，测量1～7 d的温度变化情况。同时用感官法测定难闻气味等级的大小，分为轻度（不臭或微臭）、中度（臭味较明显）、重度（臭味强烈）3个等级。

1.2 菌株鉴定

1.2.1 菌落形态及菌体形态观察

将待测4菌株（A531、B622、A422、C631）划线接种于牛肉膏蛋白胨培养基，30℃培养2 d，观察菌落及菌体形态。

1.2.2 分子鉴定及同源性比较分析

将待测4菌株保藏斜面送至上海生工测定其16S rDNA序列。将测得菌株的16S rDNA序列利用Blast软 件 中 的nucleotide blast与GenBank、EMBL及DDBJ等数据库中的已知序列进行同源性比对，得出待测菌株的初步分类结果。

1.3 功能菌剂的制备

1.3.1 斜面培养活化

将筛选得到的4株功能菌株和实验室保存的氨氧化菌BM62的原始菌种分别接种于相应的固体培养基上，将菌株A531、B622、A422和C631在30℃培养2 d，菌株BM62在50℃培养3 d使菌种活化。

1.3.2 一级种子培养

用灭菌后的牛肉膏蛋白胨培养基和氨氧化菌培养基洗涤活化斜面至无菌三角瓶中振荡培养；菌株A531、B622、A422和C631在30℃、150 r/min培养24～48 h得到一级种子液；氨氧化菌BM62在50℃、120 r/min培养72～96 h得到一级种子液。

1.3.3 二级种子培养

按液体培养基的体积比为10%～15%的接种量，将一级种子分别接种于发酵罐中，菌株A531、B622、A422和C631在30～37℃、搅拌速度为150～200 r/min，通气量为1∶（1～1.5）（V/V·min），培养2～3 d；氨氧化菌BM62在50℃、搅拌速度为120～150 r/min，通气量为（0.5～1）∶1（V/V·min），培养4～5 d，制得二级种子。

1.3.4 菌种固体发酵培养

将各菌株的二级种子发酵液与灭菌麸皮以1∶3（mL/g）的体积质量比混合发酵24～48 h后晾干，制成固体菌剂。

1.3.5 复合菌剂制备

将菌株A531、B622、A422、C631和BM62进行拮抗试验，结果表明该5株菌株不存在拮抗作用，随后将其固体菌剂按照不同质量比例混合，分别为1∶1∶1∶1∶1∶1、2∶2∶1∶1∶1 和 1∶2∶1∶2∶1 制成复合菌剂进行堆肥功能性检测。

1.4 培养基配方

（1）牛肉膏蛋白胨培养液：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，水1 000 mL。

（2）划线分离培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂20 g，水1 000 mL。

（3）羧甲基纤维素钠（CMC-Na）培养基：CMCNa 15 g，NH4NO31 g，酵母膏 1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO41 g，H2O 1 000 mL，琼脂 20 g。

（4）氨氧化菌（新型耐热芽孢杆菌）培养基：（NH4）2SO45 g，KCl 4 g，MgSO42.5 g，CaCl21.85 g，NaCl 3 g，NaHCO342 g，蛋白胨60 g，牛肉膏40 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL。

1.5 菌剂功能堆肥验证实施

堆肥原料为新鲜鸡粪和水稻秸秆，将水稻秸秆铡成3～5 cm小段，与鲜鸡粪按照1∶3～4的质量比混合均匀，调节水分含量至60%～65%，堆成发酵堆；边建堆边添加菌剂，所述菌剂的量为（8～9）×109CFU/kg堆肥原料，接种后均匀混合堆体材料；当温度上升到45℃以上时翻堆，每3 d翻堆1次，温度下降到35℃以下后每5 d翻1次，直至堆体温度下降至环境温度结束发酵。

2 结果与分析

2.1 功能菌株的筛选

通过升温、除臭和纤维素降解功能等多重筛选试验，从不同来源（土壤、堆肥、秸秆）样品中共分离纯化获得28株具有纤维素降解能力，同时具有使堆肥快速升温和有效除臭潜力的细菌，其中编号为A531、B622、A422和C631这4株菌株的各项功能均较为突出，具体筛选结果见表1。

2.2 功能菌株初步鉴定

将此4株细菌划线于牛肉膏-蛋白胨平板培养基中，30℃培养2 d后观察菌落及菌体形态，并进行基本理化性质检测，结果见表2和表3。结果表明该4株菌株的菌落、菌体特征及各项理化性质均存在一定差异，初步判断这4株菌株为分类不同的菌种。

表1 功能菌株筛选结果

表2 功能菌株菌落及菌体特征

表3 功能菌株基本生理生化特性

对4株待测菌株16S rDNA序列的V3、V4区与GenBank、EMBL及DDBJ等数据库中的已知序列进行同源性比对，结果见表4。其中菌株A531、C631的最相近菌株分别为蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）ATCC14579（T）和白色芽孢杆菌（Bacillus albus）N35-10-2（T），相似性分别为99.45%和98.89%。而菌株A422和B622的最相近菌株分别为莫哈韦芽孢杆菌（Bacillus mojavensis）RO-H-1（T）和皮特不动杆菌（Acinetobacter pittii）CIP 70.29（T），其16S rDNA序列相似性仅有94.11%和94.48%。根据现有界定新种属的规定，16S rDNA序列相似性在90%～95%为新属［15-16］，因此这两株细菌很可能是与莫哈韦芽孢杆菌和皮特不动杆菌相近的新属细菌，其具体分类鉴定还有待进一步试验测定。

表4 功能菌株分子鉴定比对结果

2.3 复合菌剂堆肥功能验证

将菌株A531、A422、B622、C631与本实验室保藏的氨氧化细菌Aliibacillus thermotoleransBM62（新型耐热芽孢杆菌）分别进行拮抗试验，结果显示该5株细菌并无明显拮抗现象。随后将该5株细菌按照不同比例配制成复合菌剂进行小型堆肥试验，以验证其堆肥升温除臭及纤维素降解效果。

2.3.1 接种菌剂各菌株比例为1∶1∶1∶1∶1的堆肥

将菌株A531、A422、B622、C631和BM62分别制成固体菌剂，按照1∶1∶1∶1∶1的比例复合接种进行堆肥试验。

堆肥结果显示，接种菌剂的堆肥在堆制后第2 d就进入高温分解阶段（＞45℃）（图1），并持续到第12 d，之后温度逐渐下降，20 d时降至35℃以下。整个堆肥过程中，高温期（2～12 d）维持11 d；自然堆肥的堆体温度虽然高于室温，但在整个试验周期内未能进入高温期。可见，接种菌剂可明显提高堆肥化过程中，尤其是堆肥前期的微生物代谢活性，从而提高堆体温度，为有机物大分子的降解提供温度保证，加快堆肥腐熟进程。

由表5可知，堆肥结束时，与对照堆肥相比，添加菌剂的堆肥中纤维素降解率提高19.83%，总氮损失率降低10%，NO2-含量增加46.6%，NH3挥发率降低35.5%，表明此复合菌剂可有效促进堆肥中纤维素类物质降解，减少NH3挥发，增加NO2-含量，从而减少氮素损失，有效降低难闻气味。

图1 接种菌剂各菌株比例为1∶1∶1∶1∶1的堆肥过程中温度变化

表5 接种菌剂各菌株比例为1∶1∶1∶1∶1堆肥中各理化指标变化

2.3.2 接种菌剂各菌株比例为2∶2∶1∶1∶1的堆肥

将菌株A531、A422、B622、C631和BM62制成的固体菌剂按照2∶2∶1∶1∶1的比例混合接种堆肥，结果表明接种菌剂的堆肥同样也是在堆制后第2 d就进入高温分解阶段（＞45℃）（图2），高温期持续了14 d，比接种复合菌剂比例1∶1∶1∶1∶1的堆肥延长了3 d。

图2 接种菌剂各菌株比例为2∶2∶1∶1∶1的堆肥过程中温度变化

由表6可知，堆肥结束时，与对照堆肥相比，添加菌剂的堆肥中纤维素降解率提高了21.73%，总氮损失率减少8.1%，NO2-含量增加39.7%，NH3挥发减少23.1%。与接种复合菌剂比例1∶1∶1∶1∶1的堆肥结果相比较，可以看出，此种配比的复合菌剂处理虽然延长了高温期，提高了纤维素的降解率，但是也增加了总氮的损失率。

2.3.3 接种菌剂各菌株比例为1∶2∶1∶2∶1的堆肥

将菌株A531、A422、B622、C631和BM62按照1∶2∶1∶2∶1的比例复配菌剂接种堆肥，结果显示接种菌剂的堆肥同样也是在堆制后第2 d就进入高温分解阶段（＞45℃）（图3），高温期持续了14 d，与接种复合菌剂比例2∶2∶1∶1∶1的堆肥温度表现相似。

表6 接种菌剂各菌株比例为2∶2∶1∶1∶1堆肥中各理化指标变化

图3 接种菌剂各菌株比例为1∶2∶1∶2∶1的堆肥过程中温度变化

由表7可知，堆肥结束时，与对照堆肥相比，添加菌剂的堆肥中纤维素降解率提高了18.86%，总氮损失率减少了11.2%，NO2-含量增加了49.1%，NH3挥发减少42.6%。与接种复合菌剂比例为1∶1∶1∶1∶1和比例为2∶2∶1∶1∶1的堆肥结果相比，此接种比例的复合菌剂使堆肥过程中的总氮损失最少，NH3挥发减少最多，纤维素降解率与前两种复合菌剂处理结果相当。此试验结果表明，接种菌剂各菌株比例为1∶2∶1∶2∶1的堆肥效果相对最好。

表7 接种菌剂各菌株比例为1∶2∶1∶2∶1堆肥中各理化指标变化

3 讨论

经多重筛选试验得到4株同时具有快速升温除臭并有效降解纤维素物质的芽孢杆菌属细菌菌株A531、B622、A422和C631，将其与本实验室保存的氨氧化菌-新型耐热芽孢杆菌Aliibacillus thermotoleransBM62按照3种不同比例配制成复合菌剂进行堆肥功能验证试验。本试验研究结果充分表明此复合菌剂兼具快速发酵产热、生物除臭保氮、快速有效分解纤维素大分子等多种功效，可使畜禽粪便堆肥快速升温，明显降低不愉快气味，降低堆肥中氮素损失，降低难降解有机物含量，从而加快堆肥物料的腐熟速度，提升堆肥产品品质。可用于生产生物有机肥，降低农业生产成本，同时解决畜禽粪便引起的环境污染，具有很好的应用价值和社会意义。

4 结论

4.1 经多重筛选试验得到4株同时具有快速升温除臭并有效降解纤维素物质的细菌A531、A422、B622和C631，其中菌株A531和C631经初步鉴定分别属于蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）和白色芽孢杆菌（Bacillus albus），菌株A422和B622的分类名称待定。

4.2 小型堆肥功能验证试验表明此4株功能菌株可与本实验室保存的氨氧化菌-新型耐热芽孢杆菌Aliibacillus thermotoleransBM62配制成功能互补的复合菌剂，该菌剂可使堆肥快速升温除臭，并使纤维素有效降解。