生槟榔中生物碱与鞣质类成分对斑马鱼急性毒性的比较研究

林青华，屈文佳，贾哲，徐新房，刘梦楠，贾天颖，周改莲，李向日,4*

(1.广西中医药大学药学院，广西 南宁 530200；2.广西中医药大学 广西壮瑶药工程技术研究中心，广西 南宁 530200；3.北京中医药大学中药学院，北京 102488；4.北京中医药大学 中药品质评价北京市重点实验室，北京 102488)

斑马鱼是辐鳍亚纲鲤科短担尼鱼属的一种硬骨鱼，其基因与人类基因相似度达87%，而且对药物的反应也与人相似[1]。斑马鱼具有体外受精、发育,胚胎透明,试验周期短,样本量大等传统动物实验和细胞试验不可比拟的优势，现已成为一种在生物学领域广泛应用模式生物[2]，并在急性毒性、发育毒性、神经毒性、血管研究和癌症研究方面显现出广阔的应用前景[3-7]。

1 材料

1.1 药材

生槟榔购于北京同仁堂药材有限责任公司，经北京中医药大学李向日教授鉴定为棕榈科植物槟榔ArecacatechuL.成熟种子的炮制品，样品留样存放于北京中医药大学中药学院炮制教研室。

1.2 动物

AB型斑马鱼幼鱼(受精卵正常发育4天)由北京中医药大学中药学院提供，斑马鱼亲本购于中国科学院武汉水生生物研究所。

1.3 仪器与试剂

斑马鱼循环水养殖系统(北京爱生科技公司)，LRH-250 Z型恒温生化培养箱(广州沪瑞明仪器有限公司)，岛津LC-20 A高效液相色谱仪(LC-20 AD泵，SPD-20 A检测器，Lcsolution处理软件，岛津公司)，Ultimater®XB-SCX色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm，月旭科技)，紫外-可见分光光度仪(北京普析通用仪器有限公司)，FA-1004电子分析天平(上海天平仪器厂)，SB 25-12 DTDN型数控超声波清洗器(宁波新芝生物科技股份有限公司)。

没食子酸对照品(天津市光复精细化工研究所，批号20121107，纯度99.0%)，槟榔碱氢溴酸盐(批号1391，纯度>98.0%)购于上海施丹德生物技术有限公司，去甲基槟榔碱氢溴酸盐(批号Q-075-170930，纯度>98.0%)、槟榔次碱盐酸盐(批号B-084-170928，纯度>98.0%)购于成都瑞芬思生物科技有限公司，去甲基槟榔次碱盐酸盐(批号JS20171103，纯度>98.0%)购于湖北巨胜科技有限公司；乙腈(色谱纯，Fisher公司)；氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、碳酸氢钠、氯化钙、盐酸、溴水、磷酸、氨水、石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮(北京化工厂)，碳酸钠、钨酸钠、硫酸锂(天津福晨化学试剂厂)，钼酸钠、明胶(天津市化学试剂厂)，干酪素(北京奥博星生物技术有限责任公司)，以上试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 斑马鱼的养殖与繁育

2.1.1 斑马鱼胚胎培养液的配制

按照Zebrafish Book标准，分别适量称取NaCl、KCl、Na2HPO4、K2HPO4、MgSO4、NaHCO3、CaCl2，最终配成每升含0.14 mol NaCl、5.4 mol KCl、0.25 mol Na2HPO4、0.44 mol K2HPO4、1.3 mol CaCl2、1.0 mol MgSO4和4.2 mol NaHCO3水溶液，即得斑马鱼胚胎培养液。

2.1.2 斑马鱼的养殖及繁育

斑马鱼在循环养殖系统中驯养，其水温为(28±0.5)℃，pH值7.0～7.2，电导率为450～550 μs/cm，每天黑暗环境(10 h)与光照环境(14 h)交替进行，以丰年虾幼虫喂食成年斑马鱼，每日3次。

暗周期开始前，将选取的雄性与雌性成年斑马鱼按照2∶1的比例放入产卵缸中，用隔板将其分开；暗周期结束后抽去隔板，雄鱼与雌鱼在光照刺激下完成交配，4 h后收集合格受精卵，将其用胚胎培养液清洗干净后转移到无菌培养皿中，置生化培养箱中孵育；每日上午更换胚胎培养液并及时除去死亡胚胎及胎衣，4 d后选取发育正常的斑马鱼幼鱼进行急性毒性研究。

2.2 试药制备

2.2.1 总生物碱的制备

称取生槟榔粉末(过80目筛)500 g，加10倍量去离子水，回流提取3次，每次1 h，合并提取液，减压浓缩至小体积，放冷；石油醚萃取3次，水层再用二氯甲烷萃取3次，合并二氯甲烷萃取液，减压回收溶剂，得二氯甲烷部位；二氯甲烷部位用去离子水复溶，滤除不容物，减压除去溶剂，得总生物碱部位(棕黄色的油状物)，备用。

2.2.2 总鞣质的制备

取生槟榔粉末100 g，加10倍量的80%丙酮超声提取2 h，滤除药渣，回收溶剂，得鞣质粗提物；将其用去离子水复溶并稀释至1 000 mL，静置，滤除沉淀，得鞣质粗提物水溶液；取明胶适量，制成1%的明胶水溶液，将其缓缓加入鞣质粗提物水溶液中，边加边搅，静置，离心(4 000 r/min，4 min)，沉淀另存，上清液再加明胶水溶液，反复数次直至无沉淀产生为止；合并沉淀物，乙酸乙酯复溶，少量多次，直至乙酸乙酯不呈明显红棕色为止，合并乙酸乙酯液，45℃减压回收溶剂，得总鞣质部位，备用。

2.3 含量测定

2.3.1 总生物碱的含量测定

按照本课题组确定的HPLC方法对总生物碱部位的含量进行测定，具体方法如下：色谱柱为Ultimate XB-SCX(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈-磷酸盐溶液(2 mL磷酸，2 mL氨水→1 000 mL)(72∶28)；检测波长为215 nm；柱温为35℃；进样体积10 μL；流速为1 mL/min。

检测结果表明所得生物碱部位中总生物碱的含量为6.67 mg/mL，其中含槟榔碱3.33 mg/mL、去甲基槟榔碱2.43 mg/mL、槟榔次碱0.23 mg/mL和去甲基槟榔次碱0.67 mg/mL。对照品及供试品色谱图具体见图1。

2.3.2 总鞣质的含量测定

鞣质部位的含量测定方法参照2015版《中国药典》(四部)中“2202鞣质含量测定法”项下内容进行含量检测，检测结果表明所得鞣质部位中总鞣质含量为53.74%。

2.4 急性毒性研究

2.4.1 总生物碱部位的急性毒性研究

精密移取总生物碱部位1.8 mL，加至38.2 mL胚胎培养液中，摇匀，得供试品母液，备用；选取发育正常的斑马鱼幼鱼置12孔板中，每孔20条，置培养箱中培养24 h，次日吸弃各孔培养液，加入4 mL用母液稀释成不同浓度的供试品溶液，置培养箱培养24 h，次日统计斑马鱼死亡情况并计算LC50，每个浓度设3个复孔。具体结果见表1。

注:色谱峰1：槟榔碱，色谱峰2：槟榔次碱，色谱峰3：去甲基槟榔次碱，色谱峰4：去甲基槟榔碱图1 对照品(A)和供试品(B)中4种生物碱在215 nm波长下的高效液相色谱图

表1 生槟榔中总生物碱部位对斑马鱼的LC50(μg/mL)

注：采用SPSS 17.0统计软件中的机率单位加权回归法(Bliss法) 计算LC50

2.4.2 总鞣质部位的急性毒性研究

精密称取鞣质部位0.099 9 g，加50 mL胚胎培养液，超声溶解，取其2.5 mL，加47.5 mL胚胎培养液，稀释，摇匀，得供试品母液，备用；选取发育正常的斑马鱼幼鱼置12孔板中，每孔20条，置培养箱中培养24 h，次日吸弃各孔培养液，加入4 mL用母液稀释成不同浓度的供试品溶液，置培养箱培养24 h，次日统计斑马鱼死亡情况并计算LC50，每个浓度设3个复孔。具体结果见表2。

表2 生槟榔中总鞣质部位对斑马鱼的LC50(μg/mL)

注：采用SPSS 17.0统计软件中的机率单位加权回归法(Bliss法) 计算LC50

3 讨论

槟榔中的生物碱属于哌啶类生物碱，是小分子液体化合物，遇热不稳定且易挥发，制备难度相对较大。本课题组在制备生物碱部位的过程中，通过比较常规萃取法(生槟榔水提物混悬液依次用石油醚、二氯甲烷萃取，回收二氯甲烷层，即得)、大孔树脂富集法(生槟榔水提液过大孔树脂，收集流出液，回收溶剂，即得)、二氯甲烷渗漉法(石油醚脱脂后的生槟榔粉末，用二氯甲烷渗漉提取，回收溶剂，即得)和“反萃法”(具体见2.2.1 生物碱部位的制备)，发现“反萃法”所得总生物碱含量(以槟榔碱、去甲基槟榔碱、槟榔次碱、去甲基槟榔次碱的总量计)高且不含鞣质类成分，故采用该法制备生槟榔中的总生物碱。

鞣质是槟榔涩味的主要成分，含量约占15%左右，但其易氧化并具有热不稳定性和光敏性的特点[13]，因此制备鞣质部位也存在一定难度。本课题组在制备鞣质部位的过程中，通过比较明胶沉淀法和大孔树脂富集法[14-15]，发现明胶沉淀法操作简单，总鞣质含量高且不含生物碱类成分，故采用明胶沉淀法制备生槟榔中的总鞣质。鉴于丙酮可以与水以任意比例混溶，而乙酸乙酯水溶性(8.3 g/100 mL，20℃)低且极性与丙酮相近，因此采用乙酸乙酯为溶剂提取明胶沉淀中的鞣质，以便利于溶剂回收，缩短鞣质受热时间。

斑马鱼急性毒性研究结果表明，生槟榔中总生物碱、总鞣质部位的LC50值分别为136.14 μg/mL(表1)和21.52 μg/mL(表2)，提示生槟榔中总鞣质对斑马鱼的急性毒性大于总生物碱，说明鞣质类成分也是生槟榔的毒性成分。由于生槟榔中鞣质含量较高，因此有必要对其毒性情况进行深入研究 。