吡非尼酮与槲皮素通过S1P/SPHK信号通路抗小鼠肺纤维化比较研究

张兴彩，蔡余力，张伟，陈宪海

(1.山东中医药大学附属医院肺病科，山东 济南 250014；2.山东中医药大学附属医院关节骨科，山东 济南 250014)

特发性肺纤维化(IPF)是由慢性的上皮细胞损伤，纤维细胞异常活跃造成的，而吡非尼酮作为IPF治疗的新晋推荐药物，具有抗炎、抗氧化及抗纤维化的作用，但吡非尼酮调节纤维增生的机制至今尚未完全清楚，其生物学活性可能是多靶点的。槲皮素是一种黄酮类化合物，存在于多种具有抗纤维化作用的草药中。我们的先期研究发现槲皮素通过抑制SphK1/S1P信号在体内和体外均可改善肺纤维化[1]。有研究表明，S1P/SphK1通过与多种细胞作用参与促纤维炎症及纤维化的过程，其中包括改变血管通透性、白细胞浸润、迁移、成纤维细胞和肌成纤维细胞的分化增殖[2-3]。本研究初步探讨吡非尼酮抗肺纤维化作用是否与调节S1P/SphK1信号通路有关，并与槲皮素进行比较，为临床用药提供更多的理论支撑。

1 材料与方法

1.1 药物及仪器

博来霉素：购自日本株式会社，规格：15 mg/支。吡非尼酮原料药：购自大连美仑生物技术有限公司。槲皮素原料购自中国上海阿拉丁生物技术有限公司。试剂：0．5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液；鞘氨醇-1-磷酸(S1P)检测试剂盒(酶联免疫吸附试验法)购自武汉优尔生科技股份有限公司，货号CEG031Ge。ExicyclerTM 96荧光定量仪(韩国BIONEER公司)，凝胶图象处理系统(Gel-Pro-Analyzer软件)。

1.2 动物造模及给药

选择成年雄性C57BL/6小鼠，8周龄，体质量(20±2)g，随机分为4组,每组20只(对照组A，博来霉素组B，博来霉素+吡非尼酮组C，博来霉素+槲皮素组D)。除对照组外，其余3组小鼠经气管滴注博来霉素(10 mg/kg，溶于100 μL生理盐水)诱导肺纤维化，对照组给予同剂量生理盐水。造模当天为第0天，从第1天开始，C组小鼠每天灌胃给药吡非尼酮(200 mg/kg，溶于0.5% CMC-Na溶液中)，D组小鼠每天灌胃给药槲皮素(100 mg/kg)200 μL共给药20 d，对照组和博来霉素组灌胃给予同剂量0.5% CMC-Na溶液。第21天，各组小鼠摘除眼球取血后腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥钠过量麻醉致死,取肺组织，部分肺组织固定于10%中性甲醛溶液中，部分肺组织液氮速冻转至-80℃保存备用。

1.3 小鼠肺间质纤维化模型病理学观察

行HE染色和Masson染色，分别于100倍和400倍光学显微镜下进行观察肺组织肺泡炎和肺纤维化程度。

1.4 Real-time PCR检测各组小鼠肺组织中鞘氨醇磷酸化酶1(SphK1)mRNA表达水平

步骤遵循试剂盒说明书,利用总RNA提取试剂盒提取样本总RNA, 将得到的RNA样本进行反转录，得到对应的cDNA，PCR反应体系包括：cDNA模板1 μL，上下游引物(10 μM)各0.5 μL，SYBR GREEN mastermix 10 μL，用ddH2O补足至20 μL，采用 Prime Premier 5.0软件进行引物设计，实验中所用到的引物如下:小鼠Sphk1(forward 5′-ACGAGCAG GTGACTAATGAAGA-3′,reverse 5′-GTGCCCACTGTGAAACGAA-3′),内参GAPDH(forward 5′-GGACGCATTGGTCGTCTGG-3′，reverse 5′-TTTGCACTGGTACGTGT TGAT-3′)本实验利用韩国BIONEER公司生产的ExicyclerTM 96荧光定量仪进行荧光定量分析,每种样本每个基因进行4个复孔平行实验，实验数据的选取，舍去误差较大的数值，取剩余数值的平均值作为最终实验保留数据，结果数据采用方程2- △△ CT计算目的基因的表达水平。

1.5 Western-blot检测各组小鼠肺组织中fibronectin(FN)、α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ和SphK1蛋白表达水平

根据每个样本的质量及体积加入相应体积的RIPA裂解液，裂解样本，然后继续置于冰上静置5 min。低温冷冻离心机，10 000 r/min，4℃，离心10 min，分离上清为所得的蛋白质抽提物。用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，取总蛋白含量为40 μg/孔上样，进行SDS-PAGE约2.5 h，电转移于PVDF膜上(电压80 V转印1.5 h) 上，用5%(M/V)脱脂奶粉稀释抗体，制成抗体工作液。一抗4℃孵育过夜。实验中所孵育的一抗分别为：fibronectin antibody(1：300,BOSTER,BA1771,中国)α-SMA antibody(1：500，BOSTER，BM4172，中国)Collagen I antibody(1：500 ，Bioss，bs-7158R，中国) Collagen III antibody(1：500 ，BOSTER，BM1625，中国) Sphk1 antibody(1：300，BOSTER，BA2865，中国)次日TBST洗膜洗4次，每次5 min，分别加入相应二抗Fibronectin,α-SMA,Collagen I,Sphk1二抗为羊抗兔IgG-HRP(1：5000，碧云天，A0208，中国)Collagen III 二抗为羊抗小鼠IgG-HRP(1：5000，碧云天，A0216，中国)37℃孵育45 min，TBST洗膜洗6次，每次5 min，后加入化学发光试剂,X 线胶片曝光。同时以内参GAPDH 进行对照，染色方法同上。将胶片进行扫描，用凝胶图象处理系统(Gel-Pro-Analyzer软件)分析目标条带的光密度值。

1.6 ELISA试剂盒检测各组小鼠血清和肺组织中1-磷酸鞘氨醇(S1P)表达水平

根据组织重量和PBS1:9匀浆。10 000 r/min,离心10 min，上清为实验所需蛋白样品，血清1 000 r/min 离心10 min，取上清即可检测。参照ELISA试剂盒说明书进行试验，以空白孔调零，酶标仪450 nm波长，依序测量各孔吸光度。每孔设3个平行孔，以标准品浓度的对数为纵坐标，OD值为横坐标，做出标准曲线，然后计算含量。

1.7 统计学方法

实验数据利用SPSS 17．0统计软件进行分析。组间数据比较采用单因素方差分析进行t检验以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HE染色及Masson染色观察各组小鼠肺部损伤情况

结果显示，10 mg/kg博来霉素经气管滴注给药，可引起小鼠肺组织严重损伤且出现严重的纤维化程度，如图1A、B所示。HE染色于100倍、400倍光镜下观察博来霉素诱导的小鼠肺组织内的病理以炎性渗出、肺泡炎为主，炎性细胞总数多，以中性粒细胞为主，可见成纤维细胞增殖及细胞外基质沉积，肺泡壁和肺泡间隔增厚明显，肺组织结构破坏严重，这也验证了10 mg/kg博来霉素诱导IPF小鼠模型建立成功， Masson染色病理学观察博来霉素诱导的小鼠肺组织内在胸膜下、大气道及血管壁周围的深蓝色基质胶原明显增多，有大量纤维组织增生，而吡非尼酮与槲皮素均可以减轻这些损伤，起到保护肺脏的作用，其中槲皮素镜下改善表现更加突出。

2.2 小鼠肺组织中纤维化相关蛋白的表达

博来霉素显著增加小鼠肺组织中纤维化相关蛋白FN，α-SMA，Collagen I, Collagen III的表达量，从分子水平上提示博来霉素诱导IPF小鼠模型建立成功，而吡非尼酮，槲皮素均可有效抑制肺纤维化相关蛋白FN，α-SMA，Collagen I的表达水平从而起到抵抗肺纤维化的作用(P<0.01)，如图2所示。这个结果与HE、Masson染色结果一致。两者比较无显著性差异。吡非尼酮与槲皮素在抑制Collagen III的表达方面均不明显，与模型组比较无显著差异。

图1 染色结果(A为HE染色结果，B为Masson染色结果)

图2 纤维化相关蛋白的表达水平

2.3 IPF小鼠模型中S1P、SphK1的表达

研究结果显示，博来霉素可显著增加S1P、SphK1的表达水平，而吡非尼酮,与槲皮素均可显著降低由博来霉素引起的肺组织中SphK1 mRNA和蛋白表达水平的升高(P<0.01)，如图3A、B所示；同时也可以显著降低由博来霉素引起的血清和肺组织中S1P的表达水平的升高(P<0.01)，如图3C、D所示。可见吡非尼酮与槲皮素对IPF小鼠模型中S1P、SphK1表达均具有一定的抑制作用，两者比较无显著性差异。

图3 IPF小鼠模型中S1P、SPHK的表达量

3 讨论

特发性肺纤维化是(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一种慢性、进行性、纤维化性间质型肺病，其病理组织学改变与普通的间质型肺炎相似，是特发性间质性肺炎中最常见的类型[4]，但发病原因尚未完全阐明，目前也没有有效的治疗手段，且患病率和病死率成逐年上升的趋势，故也成为国内外学者研究的热点之一[5-6]。最近研究证明，IPF是由慢性的上皮细胞损伤，纤维细胞异常活跃造成的[7-12]。近年来Milara等[2]研究发现在IPF患者的血清和肺泡灌洗液中S1P水平升高，且这种S1P水平升高与肺功能呈负相关性；也发现在IPF患者肺组织中SphK1表达增加与α-SMA、波形蛋白及Ⅰ型胶原蛋白的表达增加相关。成纤维细胞主要表达S1P1、S1P2和S1P3。在S1P信号反应中，S1P1介导细胞迁移和小鼠胚胎成纤维细胞增殖；相反，S1P2介导抑制细胞迁移和EMFs及人肺成纤维细胞HLF1的增殖[2-3]。King等[13]研究也证实S1P通过自分泌TGF-β的方式诱导人肺泡上皮细胞A549的上皮间质转化(EMT)，TGF-β和S1P之间的交联机制部分是依赖SphK1活性及S1P的产生。由于S1P具有类似于TGF-β的作用，S1P也可引起肺纤维细胞表达α平滑肌肌动蛋白。S1P可使肺纤维细胞转化为肌成纤维细胞，在博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型中发现，肺纤维化灶中出现高表达的SPHKl和α平滑肌肌动蛋白，当使用SphK抑制剂和siRNA基因敲除S1P2/SphK1或S1P3/SphK可降低TGF-β诱导的α-SMA、纤维连接蛋白和胶原蛋白的表达；以上研究结果表明S1P及其受体可能参与肺纤维化过程[14]。

2015年ATS/ERS/JRS/ALAT联合发表的特发性肺纤维化国际指南中吡非尼酮成为IPF治疗的新晋推荐药物。吡非尼酮是口服的吡啶类药物，能调节许多细胞因子，包括转化生长因子-β(TGF-β)、结缔组织生长因子(CTGF)、血小板衍生因子(PDGF)和肿瘤坏死因子(TNF-α)，改变胶原表达合成和累积，抑制细胞外基质增殖和表达[3]，具有抗炎、抗氧化及抗纤维化的作用。吡非尼酮调节纤维增生的机制至今尚未完全清楚，其生物学活性可能是多靶点的。银杏叶是一种中药，在抑制呼吸道炎症[15]、急性肺损伤修复[16]、肺癌恶性肿瘤抑制[17]等方面发挥作用。槲皮素是一种黄酮类化合物，存在于多种草药中，包括银杏叶[18]。已有报道槲皮素在动物模型中抑制CCl4诱导的肝纤维化、异丙肾上腺素诱导的心脏纤维化和单侧输尿管梗阻性肾纤维化[19-21]。最近，有报道称槲皮素可以减轻博莱霉素诱导的Wistar大鼠肺纤维化[22]，但其机制尚未阐明。本研究发现吡非尼酮与槲皮素抗肺纤维化作用与调节S1P/SPHK 信号通路有关，这可能是用于肺纤维化的临床治疗的原因。研究比较观察了吡非尼酮与槲皮素干预S1P/SPHK 信号通路的作用结果，认为两种药物在调节S1P/SPHK 信号通路方面未见明显差异，提示可进一步开发研究含槲皮素类药物用于肺纤维化的临床治疗，未来研究可以进一步观察两药联合使用对于肺纤维化的治疗效果是否有协同作用。