芹菜素通过抑制NF-κB信号通路缓解高糖对雪旺细胞的损伤

赵 璐，孙俊波，许 华，付婷婷，徐江雁

(1. 河南中医药大学第三附属医院内分泌科，河南郑州 450000；2. 河南省中医院内科，河南郑州 450002；3. 河南中医药大学，河南郑州 450046)

糖尿病周围神经病变(diabetic peripheral neuropathy, DPN)是2型糖尿病患者最常见的慢性并发症之一，主要临床表现为慢性远端对称性运动感觉障碍，是糖尿病患者致残的主要原因[1]。DPN主要病理基础是高血糖，以神经元的损伤和血管病变为主要特点，但具体作用机制尚未完全阐明，且现行的治疗中尚没有特效的治疗手段。大量研究显示，雪旺细胞对周围神经损伤修复、再生具有重要作用。因此，以雪旺细胞为对象研究周围神经系统损伤的发病机制和治疗措施显得尤为重要。

芹菜素(apigenin)属于黄酮类化合物，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、降血压、保护神经元等药理作用。然而，芹菜素在高糖诱导的雪旺细胞损伤方面的研究未见报道。本研究通过观察芹菜素对高糖培养条件下雪旺细胞活性、凋亡以及分泌神经生长因子(nerve growth factor, NGF)和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF-α)的影响，为进一步研究糖尿病周围神经病变的分子机制和寻找临床治疗新靶点提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料RSC96雪旺细胞株购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；DMEM(低糖)培养基、青霉素、链霉素和胎牛血清均购自美国Gibco公司；葡萄糖、胰蛋白酶和芹菜素均购自美国Sigma公司；CCK-8试剂盒、RIPA裂解液和BCA试剂盒购自上海碧云天公司；细胞凋亡检测试剂盒购自北京嘉美生物公司；TNF-α和TGF两种ELISA检测试剂盒购自美国R&D公司；Trizol试剂购于美国Invitrogen公司；逆转录及RT-qPCR试剂盒购自大连TaKaRa公司；兔抗鼠一抗Bcl-2、Bax、NF-κB、β-actin抗体以及辣根过氧化物酶标记的二抗抗体购自美国Abcam公司；酶标仪和荧光定量PCR仪购自美国Bio-Rad公司；PCR引物由上海生工公司合成；流式细胞仪产自美国BD公司。

1.2 方法

1.2.1细胞培养与实验分组 RSC96雪旺细胞接种到含100 mL/L胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 μg/mL链霉素的DMEM低糖培养基的培养瓶中，并置于37 ℃、50 mL/L CO2以及饱和湿度培养箱中培养。当细胞融合度达到90%时，用2.5 g/L胰酶消化传代。将RSC96细胞接种并按以下条件分组继续培养。实验分组如下：①对照组(Control组)，DMEM低糖培养基+100 mL/L胎牛血清+5.6 mmol/L葡萄糖；②高糖组(HG组)，DMEM低糖培养基+100 mL/L胎牛血清+50 mmol/L葡萄糖；③芹菜素组(0.1、1.0、10.0 μmol/L Api组)，在HG组培养基础上加入终浓度为0.1、1.0、10.0 μmol/L芹菜素。

1.2.2CCK-8法检测细胞活性 取对数生长期RSC96细胞接种于96孔板中，按1.2.1项的分组条件继续培养48 h。然后加入20 μL CCK-8溶液继续孵育3 h，取出培养板，放在摇床上低速振荡10 min。接着使用酶联免疫检测仪在450 nm处测量各孔的吸光度值(A值)。细胞存活率=实验组A值/对照组A值。实验独立重复3次。

1.2.3雪旺细胞凋亡的检测 取对数生长期RSC96细胞接种于6孔板中，按1.2.1项的分组条件继续培养48 h。收集细胞，PBS洗涤2次，加入400 μL×Binding Buffer悬浮细胞。然后加入5 μL Annexin V/FITC混匀，接着加入5 μL PI后再次混匀，室温下避光反应10 min。网过滤细胞，15 min后采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况(激发波长488 nm，发射波长530 nm)。

1.2.4ELISA实验 取对数生长期RSC96细胞接种于24孔板中，按1.2.1项的分组条件继续培养48 h。收集上清液，按试剂盒说明，采用ELISA实验方法分别检测NGF和TNF-α等蛋白质含量。实验重复3次，取平均值。

1.2.5qRT-PCR实验 每孔取2 mL细胞(1.5×106)接种于6孔板，实验分组及细胞处理与1.2.1项相同，细胞培养48 h后，用Trizol试剂提取各组细胞总RNA，分光光度计检测RNA的纯度及浓度；按照TaKaRa逆转录试剂盒说明书，将同一浓度的各组总RNA进行逆转录合成对应的cDNA；然后按照qRT-PCR试剂盒说明书，以cDNA为模板，以β-actin为内参，进行qRT-PCR检测。采用F=2-ΔΔCt计算待测基因的相对表达量。实验重复3次。

1.2.6Western blot实验 每孔接种2 mL细胞(1.5×106)于6孔板，实验分组及细胞处理与1.2.1项相同，细胞培养48 h后收集细胞，将收集到的细胞用RIPA细胞裂解液裂解并离心；采用BCA蛋白定量检测试剂盒检测蛋白浓度；然后进行SDS-PAGE电泳、转膜、封闭，加入Bcl-2(1∶500)、Bax(1∶500)、NF-κB(1∶500)、p-NF-κB(1∶500)一抗抗体孵育过夜；然后漂洗，加入二抗(1∶2 000)室温孵育4 h。利用免疫反应化学发光剂上机检测蛋白的表达。β-actin为内参。实验重复3次。

2 结 果

2.1 芹菜素对高糖培养条件下RSC96细胞活性的影响

CCK-8结果显示(图1)，与Control组比较，高糖组细胞活性降低，且在48 h最显著(P<0.001)。与高糖组比较，低浓度的芹菜素(0.1、1.0 μmol/L)使细胞活性显著逐渐升高(P=0.009，P<0.001)。然而，10.0 μmol/L芹菜素对细胞增殖则没有明显作用(P=0.283)。结果提示，低浓度的芹菜素可以促进高糖培养条件下RSC96细胞活性。由于1.0 μmol/L芹菜素能够显著促进细胞活性，因此我们选择该浓度进行后续试验。

图1 芹菜素对高糖培养条件下RSC96细胞活性的影响

Fig.1 The effect of apigenin on cell viability in RSC96 cells cultured with high glucose (n=3)

与对照组(Control)比较，*P<0.05；与高糖组(HG)比较，#P<0.05。

2.2 芹菜素对高糖培养条件下RSC96细胞凋亡的影响

流式细胞术检测结果显示，高糖组细胞凋亡的比例明显高于Control组(P<0.001)。加入1.0 μmol/L芹菜素之后，与高糖组比较，细胞凋亡比例明显降低(P<0.001)。Western blot和qRT-PCR结果显示，与Control组比较，高糖组Bcl-2蛋白水平(P<0.001)和mRNA表达水平(P<0.001)显著降低；加入芹菜素之后，与高糖组相比较，Bcl-2蛋白水平(P<0.001)和基因表达水平(P=0.001)显著升高。另外，芹菜素抑制高糖条件下Bax基因的蛋白(P<0.001)和mRNA水平(P<0.001)的升高(图2)。结果表明，一定浓度的芹菜素抑制高糖培养条件下RSC96细胞凋亡。

图2 芹菜素对高糖培养条件下RSC96细胞凋亡的影响

Fig.2 The effect of apigenin on cell apoptosis in RSC96 cells cultured with high glucose (n=3)

A：流式细胞仪检测细胞凋亡；B、C：qRT-PCR检测高糖培养条件下RSC96细胞中Bcl-2和Bax的mRNA表达；D：Western blot检测高糖培养条件下RSC96细胞中Bcl-2和Bax的蛋白表达；E、F：Bcl-2和Bax的蛋白定量分析结果。与对照组(Control)比较，*P<0.05；与高糖组(HG)比较，#P<0.05。

2.3 芹菜素对高糖培养条件下RSC96细胞NGF和TNF-α表达的影响ELISA法检测结果显示(表1)，与Control组比较，高糖组NGF表达水平显著降低(P<0.001)，TNF-α表达水平显著升高(P<0.001)。加入1.0 μmol/L芹菜素之后，与高糖组比较，NGF表达水平显著升高(P=0.001)，TNF-α表达水平显著降低(P=0.001)。以上结果表明，一定浓度的芹菜素促进高糖培养条件下RSC96细胞NGF表达，并且抑制TNF-α表达。

表1 芹菜素对高糖培养条件下RSC96细胞NGF和TNF-α表达的影响

组别NGFTNF-αControl组25.230±2.5325.39±3.48HG组9.860±0.98*43.94±4.39*HG+Api组19.380±2.35#31.56±2.76#

与对照组(Control)比较，*P<0.05；与高糖组(HG)比较，#P<0.05。

2.4 芹菜素对高糖培养条件下RSC96细胞NF-κB表达的影响Western blot结果显示(图3)，与Control组比较，高糖组NF-κB蛋白磷酸化水平显著增加(P<0.001)。与高糖组比较，1.0 μmol/L芹菜素显著降低NF-κB蛋白的磷酸化水平(P<0.001)。这些结果表明，一定浓度的芹菜素抑制高糖培养条件下RSC96细胞NF-κB表达。

图3 芹菜素对高糖培养条件下RSC96细胞NF-κB表达的影响

Fig.3 The effect of apigenin on the expression level of NF-κB in RSC96 cells cultured with high glucose

A：Western blot检测高糖培养条件下RSC96细胞中p-NF-κB和NF-κB的蛋白表达；B：蛋白定量分析结果。与对照组(Control)比较，*P<0.05；与高糖组(HG)比较，#P<0.05。

3 讨 论

雪旺细胞是周围神经特有的髓鞘形成细胞，在神经损伤修复再生中发挥重要作用[2]。当外周神经发生损伤时，雪旺细胞大量增殖，形成Bunner带并分泌各种神经营养因子，参与调控神经修复与再生[3]。长期高血糖可以破坏雪旺细胞活性，影响受损的周围神经再生，是DPN的重要病理机制。因此，促进雪旺细胞增殖及神经营养因子的分泌对DPN的治疗具有重要意义。芹菜素，别名芹黄素、洋芹素，主要存在于伞形科植物旱芹中，具有较高的药用价值。近年来，有关芹菜素的中枢神经系统保护作用逐渐受到关注[4]。ZHANG等[5]研究发现，芹菜素可以促进脊髓损伤导致的神经功能的恢复。ANUSHA等[6]研究发现，在鱼藤酮诱导的帕金森动物模型中，芹菜素通过抑制神经炎症和氧化应激发挥神经保护作用。HAN等[7]研究发现，芹菜素可以缓解在蛛网膜下出血引起的脑损伤过程中神经元的凋亡。本研究发现，一定浓度的芹菜素可以促进高糖培养条件下雪旺细胞的活性，并且抑制其凋亡，而高浓度的芹菜素对高糖培养条件下雪旺细胞的活性没有促进作用，可能与高浓度药物的细胞毒性有关。结合以上研究结果，我们推测芹菜素对治疗糖尿病周围神经病变有重要作用。

NGF是神经营养因子家族成员之一，由交感神经元及其支配的靶器官的细胞组织内合成释放，对神经的营养、再生、修复及功能维持等有重要的生物学意义[8]。DPN患者和动物模型中NGF水平明显减少，补充外源性NGF有助于DPN神经损伤修复[9]。盛华刚等[10]研究发现，NGF可以通过调节PI3K/Akt/GSK3β和ERK1/2信号通路，降低高糖诱导的雪旺细胞凋亡水平，进而发挥治疗DPN的作用。同时，近年来研究发现DPN与炎症反应有关。研究发现，DPN发展过程中TNF-α表达显著升高，抑制TNF-α表达可以缓解DPN，促进周围神经修复[11-12]。芹菜素的药理作用中包括抗炎以及对神经系统的保护作用，而有关芹菜素在高糖培养条件下雪旺细胞中NGF和TNF-α表达水平的影响未见报道。因此，我们通过ELISA法检测了二者的表达情况，结果发现一定浓度的芹菜素可以促进NGF的表达，并抑制TNF-α的表达。

NF-κB参与调节免疫反应、应激反应、炎症反应及细胞存活、凋亡等重要的病理生理过程。NF-κB与DPN的病程进展密切相关，其抑制物可以缓解糖尿病神经病理病变[13]。封莎等[14]研究发现，芹菜素在大鼠局灶性脑缺血再灌注中可以通过调控TLR4/NF-κB表达发挥神经保护作用。与他们的研究结果类似，本研究也发现芹菜素可以抑制高糖培养条件下雪旺细胞中NF-κB的磷酸化水平。提示芹菜素可能是通过降低NF-κB磷酸化水平从而增加高糖培养条件下雪旺细胞的活性，完成神经修复，缓解DPN病程，进而发挥对DPN的神经保护作用。

综上所述，本研究发现芹菜素可以增加高糖培养条件下雪旺细胞活性，抑制细胞凋亡，增加NGF表达，并抑制TNF-α表达，推测其机制可能与抑制NF-κB信号通路相关。此外，芹菜素在DPN动物水平的研究后续需要进一步补充。相信通过对芹菜素在DPN功能以及分子机制的更深入研究，有望为治疗DPN提供一个新方向。