乳腺癌BRCA1相互作用蛋白1基因功能区单核苷酸多态性与习惯性流产的相关性

罗 莉，魏曙光，常 辽，李生斌，赵 静

(1. 西安交通大学附属广仁医院，陕西西安 710004；2.西安交通大学法医学院，陕西西安 710061)

习惯性流产(recurrent miscarriages, RM)是指连续2次或2次以上的流产。RM的原因极其复杂，包括遗传、免疫、解剖、内分泌、感染等各方面的异常，且近50%的RM原因仍然不清楚，即原发性RM[1]。RM受遗传与环境因素共同作用。家系、双生子及寄养子研究表明，RM的遗传度为40%～60%[2]。宫颈癌与乳腺癌易感基因相互作用蛋白 1(BRCA1-interactingprotein 1, BRIP1)基因在妇女相关疾病中被广泛研究[3-5]，然而BRIP1基因与RM的相关性研究尚未见报道。因此，本研究选择BRIP1基因5′非翻译区(5′ untranslated region, 5′UTR)rs2048718、外显子18(Exon)rs4986764、外显子20 rs4986763、3′非翻译区rs11079454共4个位点与RM进行关联分析。

1 材料与方法

1.1 研究对象与分组于2014年5月-2017年12月收集我院RM患者外周静脉血291份(RM≥2)作为病例组，选择281例正常分娩者的外周静脉血作为对照组。排除标准：女性生殖系统慢性疾病或肿瘤；生殖器官畸形；有流产史或宫外孕；神经精神疾病；心血管系统疾病；免疫系统疾病；感染性疾病等。所有研究对象均为汉族，祖籍中国北方。经知情同意采取外周静脉血2～5 mL，-80 ℃保存待提取基因组DNA。

1.2 研究方法采用Omega Blood DNA Kit试剂盒提取基因组DNA。采用MassARRAY技术对SNP进行引物设计及基因分型。PCR反应体系为DNA样本5 ng/μL，PCR Buffer 0.625 μL，MgCl20.325 μL，dNTP、引物、HotstarTaq0.1 μL。PCR反应条件：94 ℃ 15 min；94 ℃ 20 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，72 ℃ 3 min，4 ℃保存，共45个循环。延伸反应体系为iPlex Buffer (10×)0.2 μL，iPlex Termination mix 0.2 μL，引物 0.804 μL，iPlex enzyme 0.041 μL，终体积为2 μL。PCR反应条件：94 ℃ 30 s，94 ℃ 5 s，52 ℃ 5 s，80 ℃ 5 s，72 ℃ 3 min，4 ℃保存。将检测样品从384孔反应板转移到表面覆盖基质的MassARRAY SpectroCHIP芯片，放入质谱仪进行检测，全自动分析。TYPER软件分析实验结果获得分型数据。

1.3 统计学分析基因频率使用基因计数法计算。采用SPSS 20.0软件进行统计分析。Hardy-Weinberg平衡检验采用Pearson’s卡方检验；基因型及等位基因频率在病例组及对照组中差异分析采用卡方检验，优势比(OR)及95%可信区间(95%CI)采用二元回归。单倍型分析采用Haploview4.2软件，单倍型频率采用近似法进行计算，单倍型频率在病例组及对照组中差异分析采用卡方检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Hardy-Weinberg平衡检验BRIP1基因rs2048718、

rs4986764、rs4986763及rs11079454位点对照组基因型频率分布符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，表明该群体具有代表性(表1)。

2.2 病例组与对照组基因型及等位基因频率分布BRIP1基因外显子18 rs4986764位点TT、CT及CC基因型在对照组及病例组之间分布频率不同，病例组CC基因型频率明显高于对照组(χ2=6.469，P=0.039)；病例组C等位基因频率显著高于对照组(χ2=4.893，P=0.027，OR=1.330，95%CI=1.033-1.714)。rs2048718、rs4986763及rs11079454 SNP位点基因型与等位基因在对照组及病例组频率分布无统计学差异(表1)。

表1 BRIP1基因型及等位基因频率在病例组及对照组中的分布

Tab.1 The genotype and allele frequency of BRIP1 in patients and healthy controls

位点位置组别MAF基因型[n(%)]Paχ2, Pb等位基因[n(%)]χ2, PcOR, 95% CITTTCCC〛TCrs20487185'UTR对照组0.231163(58.21)104(37.14)13(4.64)0.482.762, 0.251430(76.79)130(23.21)0.402, 0.5261.094, 0.828-1.445病例组183(62.89)90(30.93)18(6.19)〛456(78.35)126(21.65)CCCTTT〛CTrs4986764Exon 18对照组0.338120(43.17)129(46.40)29(10.43)0.516.469, 0.039369(66.37)187(33.63)4.893, 0.0271.330, 1.033-1.714病例组156(53.79)108(37.24)26(8.97)〛420(72.41)160(27.59)CCCTTT〛CTrs4986763Exon 20对照组0329122(45.52)114(42.54)32(11.94)0.503.504, 0.173358(66.79)178(33.21)2.966, 0.0851.251, 0.969-1.613病例组155(53.45)105(36.21)30(10.34)〛415(71.55)165(28.45)TTTAAA〛TArs110794543'UTR对照组0.47286(30.71)132(47.14)62(22.14)0.401.616, 0.446304(54.29)256(45.71)0.169, 0.6811.050, 0.832-1.326病例组86(29.55)151(51.89)54(18.56)〛323(55.50)259(44.50)

aP对照组Hardy-Wenberg平衡检验;bP基因型频率组间差异统计结果；cP等位基因频率组间差异统计结果；MAF：最小等位基因频率分布。

2.3 单倍型频率分布连锁不平衡分析发现有rs11079454-rs4986763-rs494986764构成的单倍型高度连锁(D’>0.9，r2>0.8)。对照组T-T-T单倍型频率明显高于病例组(χ2=8.043，P=0.005，OR=0.565，95%CI=0.381-0.840)；病例组T-C-C单倍型频率明显高于对照组(χ2=4.392，P=0.036，OR=1.540，95%CI=1.027-2.310)(图1)。

图1 BRIP1基因4个SNP位点连锁不平衡结果

Fig.1 The result of linkage disequilibrium analysis of four SNPs on BRIP1

3 讨 论

BRIP1是一种与乳腺癌易感基因1(breast cancer 1, BRCA)相互作用的DNA解旋酶，在基因组稳定与DNA修复中发挥重要作用[6]。该基因在染色体上定位于17q22，编码1 249个氨基酸，含19个内含子、20个外显子，基因跨度为184 kb(61679186,61864120)。研究表明，BRIP1基因与多种疾病密切相关[3-5,7-8]。然而，BRIP1基因对RM的研究尚未见报道。

我们选择了BRIP1基因非翻译区和外显子区4个SNP位点。外显子决定氨基酸的排列，有意或无意的突变均会影响蛋白质的氨基酸序列或转录效率，从而影响蛋白质的功能。研究发现，第3个核苷酸可以影响翻译的效率，原来在氨基酸表达翻译时，其密码子的优先度不一样。原核和真核生物在表达翻译时，同一氨基酸翻译时优先的密码子也不同。因此，如果外显子区域发生的基因突变，即使没有改变蛋白的序列，也很有可能改变了其翻译的效率[9]。非翻译区虽然不是构成该基因的蛋白质编码区，但在5′非翻译区内的上游可读框可以被翻译成多肽。5′UTR可能含有以下调控序列：①蛋白质结合位点，这可能会影响mRNA的稳定性或翻译；②核糖开关；③促进或抑制翻译起始的序列；④5′UTR的内含子与调控基因表达和mRNA出核转运有关。3′UTR在mRNA转运、稳定性和翻译调节中起重要作用。

本研究结果显示，BRIP1基因外显子18 rs4986764病例组CC基因型频率明显高于对照组，病例组C等位基因频率明显高于对照组。该结果提示，BRIP1基因rs4986764位点C等位基因为风险因子，携带有C等位基因的个体可能更容易患RM。本研究首次表明BRIP1基因与RM具有相关性。但BRIP1基因在乳腺癌、卵巢癌等其他女性相关疾病中的作用已有广泛研究。例如，REN 等[10]研究发现，乳腺癌患者rs4986764位点C等位基因频率明显高于对照组；LIU等[11]对18项研究包括中国13 716个癌症患者及15 590个健康对照个体的BRIP1基因rs4986764位点进行meta分析表明，rs4986764位点与降低癌症风险相关。这些研究表明，rs4986764位点变异很可能影响BRIP1基因功能，进而影响多种女性相关疾病易感性。本研究的单倍型分析结果显示，rs11079454-rs4986763-rs494986764构成的T-T-T单倍型对照组频率明显高于病例组，病例组T-C-C单倍型频率明显高于对照组，表明T-T-T为保护单倍型，而T-C-C为风险单倍型，进一步支持了BRIP1基因rs4986764位点C等位基因为风险因子。

综上所述，本研究表明，BRIP1基因外显子18的rs4986764位点与RM有关，CC基因型是RM的易感位点，但关于该多态性位点如何调控BRIP1基因的表达水平，以及对RM发生机制的影响，还需进一步研究。