螺内酯对慢性房颤模型兔心房结构重构的影响

杨 倩， 王立立， 田国栋， 宋学莲， 孟存良

(1河北省人民医院心内科， 河北 石家庄 050051； 2容城县人民医院心内科， 河北 容城 071600)

心房颤动(atrial fibrillation，AF)，简称房颤，是临床上最常见的心律失常[1]，它可以导致心衰和脑卒中等多种并发症，并可引起死亡率增加[2]。随着我国人口老龄化进程的加速，房颤的发病率逐渐增加， 已经成为影响公众健康和加重社会负担的重要疾病[3]，但目前房颤的治疗效果尚不尽如人意。因此，了解房颤的发病机制，从而探索房颤治疗的新方法，仍是临床亟待解决的问题。

心房结构重构在房颤的发生和维持中发挥重要作用，它可以导致房内及房间传导延迟、传导异质性增加，促进折返形成，从而导致房颤[4-5]。近年来的研究表明，基质金属蛋白酶(matrix metalloproteina-ses，MMPs)，尤其是MMP-2和MMP-9的表达及活性增加是引起心房结构重构的关键因素[6-7]，而螺内酯(spironolactone，SP)可以抑制MMPs的表达[8-9]。本研究通过快速心房起搏(rapid atrial pacing, RAP)3周建立兔慢性房颤模型，探讨螺内酯对于该模型兔心房结构重构及MMPs表达的影响。

材 料 和 方 法

1 动物和材料

选用新西兰兔24只作为实验对象，体重2.5～3.5 kg，由河北医科大学动物实验中心提供(合格证号：11400700277731)。动物心脏起搏器购自上海复旦旦华科技有限公司，起搏电压5 V，起搏频率为 600次/分。采用Philip IU22超声诊断仪测定各项心脏超声指标；采用苏州东方DF-5A型电生理刺激仪行心房Burst刺激。抗Ⅰ型胶原蛋白(collagenⅠ)和Ⅲ型胶原蛋白(collagenⅢ)抗体购自Bioworld;抗MMP-2、MMP-9和内参照β-actin抗体均购自ProteinTech。

2 主要方法

2.1兔房颤模型的建立 动物用3%戊巴比妥钠(1 mL/kg)经耳缘静脉注射麻醉，仰卧位固定于动物手术台上，备皮，于胸骨左缘第3、4肋间打开胸腔，暴露心脏，找到左心房，采用结扎左心耳的方法将起搏电极固定于左心房，引出电极，关闭胸腔。电极沿皮下隧道移行至右侧后背部，应用电生理刺激仪测试电极，保证裸露导线与心房肌接触良好，且与胸壁绝缘。于兔右侧背部脊柱旁制作起搏器囊袋，庆大霉素冲洗囊袋后，将动物起搏器与起搏电极连接固定，起搏器设置为关闭状态，置于皮下囊袋中[10]。术后用青霉素抗感染治疗，恢复1周。

2.2实验分组 实验兔随机分为3组：RAP和螺内酯组(RAP+SP组)给予开胸、固定左心房电极、持续心房起搏3周，自起搏开始前3 d至起搏3周结束，每日分别给予生理盐水10 mL和螺内酯20 mg/kg(溶解于10 mL生理盐水中)灌胃；假手术组(sham组)仅给予开胸、固定左心房电极，不起搏，不给药。每日行心电图检查，保证起搏器正常工作。

2.3超声心动图指标的测定 采用超声诊断仪于起搏前、后行经胸无创心脏超声检查，测量左心房内径(left atrial diameter，LAD)。于心尖4腔切面及心尖两腔切面，应用双平面面积长度法，在二尖瓣开放前测量左心房最大容量(left atrial maximal volume，LAVmax)；在舒张末期(二尖瓣关闭后)测量左心房最小容量(left atrial minimal volume，LAVmin)。左心房射血分数(left atrial ejection fraction，LAEF)通过应用公式计算得出：LAEF(%)=(LAVmax-LAVmin)/LAVmax×100%[11]。

2.4房颤诱发率的测定 采用电生理刺激仪于起搏前、后行心房Burst刺激测定房颤诱发率。给予S1S1刺激，周长50 ms，电压为2倍舒张期阈值电压+0.5 V，重复8次(前4次每次6 s，后4次每次12 s)[12]。应用公式：房颤诱发率(%)=诱发房颤成功兔只数/行Burst刺激兔总只数×100%进行计算。

2.5心房间质纤维化程度的测定 采用4%多聚甲醛溶液固定左心房组织，石蜡包埋后制成厚度约为5 μm的石蜡切片，行Masson染色。显微镜下，心肌间质纤维呈蓝色，心肌细胞呈红色。每个标本选取5个视野，使用Image-Pro Plus 6.0软件对获得的图片进行图像分析，心房纤维化百分比(%)=心房纤维组织面积/(心房纤维组织面积+心房肌组织面积)×100%[12]。

2.6心房collagenⅠ、collagenⅢ、MMP-2和MMP-9蛋白表达水平的测定 取左心房心肌组织剪碎，用RIPA裂解液抽提心房肌组织总蛋白，Bardford比色法测定抽提蛋白的浓度。按照说明书进行操作，蛋白样品与4×蛋白质凝胶电泳上样缓冲液混合后电泳，然后采用半干转的方法转移到PVDF膜，PVDF膜经5% BSA封闭2 h，于经PBS稀释的Ⅰ抗工作液中4 ℃反应过夜，再经1×PBST稀释3 000倍的Ⅱ抗工作液处理90 min，蛋白条带通过显影定影液显色后，采用UVP分析仪器，对胶片进行扫描分析，系统自动生成灰度值。

3 统计学处理

运用SPSS 19.0软件包分析处理数据。计量资料采用均数±标准差(mean±SD)表示，各组组内前后测量数据比较采用配对样本t检验，3组间比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 动物的一般情况

Sham组家兔因手术死亡1只，RAP组和RAP+SP组各有1只因起搏电极脱位未完成实验而剔除。

2 超声心动图中各项指标的变化

起搏前3组兔心房的各项超声指标的差异均无统计学显著性(P>0.05)。起搏3周后，RAP组和RAP+SP组兔左心房较假手术组明显扩张，LAD、LAVmax和LAVmin明显增加(P<0.05)，LAEF明显下降(P<0.05)，但RAP组和RAP+SP组相比较，LAD、LAVmax、LAVmin和LAEF的差异无统计学显著性(P>0.05)，见表1。

表1 左心房结构和功能的变化

*P<0.05vsbaseline;#P<0.05vssham group.

3 房颤诱发率的变化

起搏前对3组兔经心房Burst刺激均未能诱发房颤。起搏3周后，经心房Burst刺激后，sham组的动物均未诱发房颤，RAP组7只兔均诱发持续性房颤(诱发率100%)，RAP+SP组7只兔中有5只诱发持续性房颤(诱发率71%)。

4 心房纤维化程度的变化

起搏3周后，RAP组心房纤维化百分比较sham组明显增加(P<0.05);RAP+SP组心房纤维化百分比较sham组明显增加(P<0.05)，但较RAP组明显下降(P<0.05)，见图1。

Figure 1. The left atrial myocardium with Masson trichrome-staining of the 3 groups after 3 weeks of RAP (×200). Mean±SD.n=7.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsRAP group.

图1 起搏3周后3组兔左心房的Masson染色观察

5 心房collagenⅠ和collagenⅢ蛋白表达水平的变化

起搏3周后，RAP组和RAP+SP组的collagenⅠ和collagenⅢ蛋白表达水平较假手术组均明显增加(P<0.05)，但RAP+SP组collagenⅠ和collagenⅢ的蛋白水平较RAP组下降(P<0.05)，见图2。

Figure 2. The protein expression of collagenⅠand collagen Ⅲ in the left atria. Mean±SD.n=7.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsRAP group.

图2 左心房Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的表达水平

6 心房MMP-2和MMP-9蛋白表达水平的变化

起搏3周后，RAP组和RAP+SP组的MMP-2和MMP-9蛋白表达水平较sham组均明显增加(P<0.05)，但RAP+SP组MMP-2和MMP-9的蛋白水平较RAP组下降(P<0.05)，见图3。

Figure 3. The protein expression of MMP-2 and MMP-9 in the left atria. Mean±SD.n=7.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsRAP group.

图3 左心房MMP-2和MMP-9蛋白表达水平的变化

讨 论

房颤发生和维持的主要机制是心房重构，包括电重构和结构重构。相较于电重构，结构重构不完全可逆，其在房颤的发生和维持中发挥更为重要作用，主要表现为心房扩张和间质纤维化[4]。左房扩张是房颤的独立危险因素[13]，相对于左心房内径而言，左心房容积在预测房颤复发方面是更准确的参考指标。心房间质纤维化是结构重构的特征性改变，持续性房颤患者心房间质纤维化程度明显增加[14]。我们既往的研究表明[10]，快速起搏兔心房3周可引起左心房容积明显扩张，间质纤维化程度明显增加，但左心室的结构和功能均不受影响，因此兔慢性房颤模型是研究药物对心房结构重构的理想模型。本研究应用兔慢性房颤模型进行研究，结果显示：螺内酯能够抑制心房Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白表达，抑制兔心房间质纤维化，从而抑制心房结构重构；螺内酯对于心房扩张无明显作用，这可能与心房扩张明显(LAVmax约为假手术组4倍)，而药物干预时间相对较短有关。

MMPs是一组存在于细胞外基质的蛋白水解酶，生理状态下，激活的MMPs能够降解细胞外基质蛋白，维持心肌间质纤维蛋白稳定性；病理状态下，MMPs的过度激活则与心肌间质纤维化密切相关。多项临床研究和动物实验显示，MMPs，特别是MMP-2和MMP-9的表达和活性增加与心房结构重构密切相关，其可以引起心房细胞外胶原沉积增加，导致心肌纤维化水平增加[10, 15]；抑制MMPs可以使心肌纤维化水平下降，进而降低房颤诱发率和诱发房颤的持续时间[9]； MMPs水平不仅与心血管人群房颤的发生相关[16]，还与射频消融术后房颤的复发相关[17]。

醛固酮受体拮抗剂螺内酯可能通过抑制醛固酮所致的氧化应激反应，抑制心肌组织MMPs的表达和活性，从而发挥抑制心房结构重构的作用。Zhao等[9]的研究显示，螺内酯可以抑制慢性房颤模型犬心房MMP-9的表达，增加金属蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP)-1的表达，从而抑制心房结构重构，但其未评估螺内酯对于心肌组织MMP-2的作用。本研究评估了螺内酯对慢性房颤模型兔心房结构重构的作用，并对MMP-2和MMP-9可能发挥的作用进行了探讨，结果显示,螺内酯能够下调慢性房颤模型兔心房MMP-2和MMP-9蛋白的表达，这可能是其抑制心房结构重构的潜在作用机制。