血管紧张素Ⅱ诱导高血压大鼠肠系膜动脉PP2A激活的机制研究*

于 敏， 姜君财， 骆妍蓓， 张 倩， 丁 菁， 陆德琴

(贵州医科大学病理生理学教研室， 贵州省常见慢性疾病发病机制及药物研究重点实验室， 贵州 贵阳 550025)

高血压是一种以体循环动脉血压升高为主要特点的临床综合征，可导致脑卒中、肾衰竭及心力衰竭等严重并发症。高血压的发病机制复杂，其中肾素-血管紧张素系统 (rennin-angiotensin system, RAS) 的异常激活被认为是其重要的发病机制之一[1]。血管紧张素Ⅱ (angiotensinⅡ, AngⅡ) 是RAS的主要组成部分，可通过与其1型受体 (AngⅡ type 1 receptor，AT1R) 结合参与多种心血管疾病的发生[2-3]。有研究报道， AngⅡ的慢性升高可导致内皮型一氧化氮合酶 (endothelial nitric oxide synthase, eNOS) 活性降低以及一氧化氮 (nitric oxide, NO) 生成减少，进而引起血管内皮功能障碍 (vascular endothelial dysfunction, VED) 和高血压的发生[2,4]。生理条件下，血管壁的NO主要由内皮细胞的eNOS催化生成[5-6]，eNOS/NO功能障碍是心血管疾病发生的关键环节。eNOS的活性调节复杂，蛋白质翻译后磷酸化调控是其活性调节的重要机制之一，eNOS Ser1177是其中一个重要的磷酸化位点，该位点磷酸化水平上调可增强eNOS活性[7]。

蛋白磷酸酶2A (protein phosphatase 2A，PP2A) 是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶，其通过使蛋白质发生可逆性去磷酸化，在细胞信号转导、细胞分化和DNA复制等多种生物学事件中发挥调控作用[8]。文献报道，PP2A可使eNOS Ser1177去磷酸化而下调eNOS活性[9-10]。AngⅡ是激活PP2A的多种因素之一。研究表明，AngⅡ与心肌细胞膜上AT1R结合后可介导PP2A激活，进而使心肌细胞翻译延长因子2去磷酸化，调控细胞内蛋白质的合成和心肌肥大[11]。本课题组前期研究[12-13]也观察到双肾单夹 (two-kidney one-clip, 2K1C) 肾血管性高血压大鼠血清AngⅡ含量升高，肠系膜动脉PP2A活性增加、eNOS Ser1177磷酸化水平下调、eNOS活性降低及NO生成减少，并且利用PP1/PP2A抑制剂冈田酸 (okadaic acid，OA) 以及AT1R阻滞剂坎地沙坦 (candesartan，CAN) 均可逆转上述现象，表明AngⅡ/AT1R通路可激活PP2A，降低eNOS活性。但是，AngⅡ激活血管内皮细胞PP2A，进而导致内皮功能障碍的分子机制目前仍不清楚。因此，本研究利用微量渗透泵持续灌注AngⅡ的方法构建高血压大鼠模型，从动物整体水平探讨AngⅡ/AT1R通路激活肠系膜动脉PP2A的分子机制，以期为临床防治与AngⅡ密切相关的心血管疾病提供实验依据。

材 料 和 方 法

1 实验动物

清洁级雄性6周龄Sprague-Dawley (SD)大鼠40只，体重160～200 g，由贵州医科大学实验动物中心提供，许可证号为SCXK (黔) 2012-0001。本研究的动物实验方案经贵州医科大学实验动物伦理委员会批准。

2 实验试剂与仪器

3 方法

3.1高血压大鼠模型复制方法及实验分组 大鼠常规适应性喂养1周后，随机分为对照(control)组 (n=10)、AngⅡ组 (n=10)、CAN+AngⅡ组 (n=10)和CAN组 (n=10)。高血压大鼠模型复制方法简单描述如下：腹腔注射3%戊巴比妥钠 (1 mL·kg-1)麻醉后，行颈背部皮肤横切口，在皮下埋置预先严格按照产品说明书充填AngⅡ或生理盐水的微量渗透泵，然后用手术丝线缝合切口，所有操作均按照外科无菌术原则。AngⅡ组及CAN+AngⅡ组埋置AngⅡ微量渗透泵 (500 ng·kg-1·min-1)，control组及CAN组埋置生理盐水微量渗透泵 (500 ng·kg-1·min-1)。CAN+AngⅡ组与CAN组于皮下埋泵术后第1天给予坎地沙坦酯 (10 mg·kg-1·d-1) 灌胃，control组和AngⅡ组给予等量生理盐水灌胃。各组大鼠均以普通饲料、自由饮水喂养14 d。

3.2血压测量及高血压判定 采用BP-300A大鼠无创血压测量仪测定大鼠清醒状态下尾动脉收缩压，测量时间为埋置微量渗透泵前及埋置后3 d、7 d和14 d。每次测量均连续测6次，去掉最高值及最低值，取其余数值的平均值为当天收缩压值。血压在85～120 mmHg范围为正常血压大鼠，凡术后血压比自身术前血压升高≥30 mmHg者判定为高血压。

3.3标本收集

3.3.1分离血清 SD大鼠取材前禁食10 h，用3%戊巴比妥钠 (1 mL·kg-1) 腹腔麻醉后股动脉放血，留取血液至15 mL离心管中，于4℃静置30 min后，4 ℃、3 000×g离心15 min，取上清，置-80 ℃冰箱保存备用。

3.3.2分离肠系膜动脉 取血后迅速剪开大鼠腹腔，于心脏未停止搏动前沿肠管壁剪取肠系膜组织，置于预冷的无菌PBS中，轻柔地将血管外脂肪、结缔组织剥离后留取肠系膜动脉血管，迅速放入液氮中冷冻，用锡箔纸包装冷冻后的动脉，置-80 ℃保存待用。

3.4血清AngⅡ含量测定 取-80 ℃保存的各组大鼠血清，置常温下解冻后混匀备用。严格按照ELISA试剂盒说明书操作，用酶标仪在 450 nm 波长下读取吸光度 (A) 值，并根据标准曲线计算各样本AngⅡ含量。

3.5Western blot检测蛋白水平 取-80 ℃保存的肠系膜动脉组织，称重后加液氮研磨至细粉末状，加入蛋白裂解液 (1 mL/g) 混匀后于冰上裂解45 min，超声波破碎3次后，4 ℃、 12 000×g离心15 min，取上清液，BCA法测定样品总蛋白浓度后，加入3×上样缓冲液煮沸变性。经10% SDS-PAGE分离，蛋白质转移至PVDF膜，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，TBST洗膜后分别加入相应I抗，4℃孵育过夜。次日，洗膜后加入Ⅱ抗室温孵育1 h，ECL显影，于Bio-Rad凝胶成像系统曝光。曝光后的条带用Image Lab图像分析软件进行分析，以β-tubulin为内参照。

3.6PP2A酶活性检测 取-80 ℃保存的肠系膜动脉组织，称重后加液氮研磨至细粉末状，加入预冷的磷酸酶贮存缓冲液后冰上裂解45 min，4℃、 12 000×g离心45 min，取250 μL上清液，将上清液过柱后收集滤出液， 严格按照PP2A检测试剂盒说明书操作进行检测。用酶标仪在600 nm波长处测定吸光度 (A) 值，根据标准曲线计算样品PP2A的酶活性。

4 统计学处理

采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析。实验数据以均数±标准差 (mean±SD) 表示，组间比较采用单因素方差分析 (one-way ANOVA)。相关性分析采用Pearson相关分析法。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 各组收缩压变化

与control组及自身术前相比，AngⅡ组大鼠术后第3天收缩压显著升高 (P<0.05)，第7天收缩压进一步升高 (P<0.05)，第14天在高水平持续(P<0.05)；与AngⅡ组比较，CAN+AngII组大鼠收缩压显著降低 (P<0.05)；control组、CAN组及CAN+AngⅡ组大鼠手术前后收缩压以及各组间收缩压差异均无统计学意义，见表1。

表1 各组收缩压的变化

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsbefore minipump implantation;△P<0.05vs3 d after minipump implantation;▲P<0.05vsAngⅡ group.

2 血清AngⅡ含量

与control组相比，AngⅡ组和CAN+AngⅡ组血清中AngⅡ含量均显著升高 (P<0.05)，CAN组血清中AngⅡ含量差异无统计学意义，见表2。

表2 各组血清AngⅡ含量变化

Table 2. The changes of serum AngⅡ in each group (ng/L. Mean±SD.n=6)

GroupAng ⅡControl15.02±3.07AngⅡ18.42±2.07∗CAN+AngⅡ17.70±3.99∗CAN14.07±2.72

*P<0.05vscontrol group.

3 肠系膜动脉eNOS蛋白表达及eNOS Ser1177磷酸化水平

与control组相比，AngⅡ组肠系膜动脉eNOS Ser1177磷酸化水平显著降低 (P<0.05)，其余两组差异无统计学意义；与AngⅡ组相比，CAN+AngⅡ组eNOS Ser1177磷酸化水平显著上调 (P<0.05)；各组间eNOS蛋白表达差异无统计学意义，见图1。

4 肠系膜动脉PP2A活性

与control组相比，AngⅡ组肠系膜动脉PP2A活性显著增高 (P<0.05)，其余两组差异无统计学意义；与AngⅡ组相比，CAN+AngⅡ组PP2A活性显著降低 (P<0.05)，见图2。

5 PP2A活性与eNOS Ser1177磷酸化水平相关性分析

Pearson相关性分析显示，PP2A活性变化与eNOS Ser1177磷酸化水平改变呈负相关，相关系数为r=-0.842 (P<0.05)。

6 肠系膜动脉PP2Ac Tyr307磷酸化水平和蛋白表达

Figure 1. The protein levels of eNOS and p-eNOS (Ser1177) in the mesenteric arteries of AngⅡ-induced hypertensive rats and the blocking effect of CAN. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAngⅡgroup.

图1 各组大鼠肠系膜动脉eNOS蛋白表达及eNOS Ser1177磷酸化水平的变化

Figure 2. PP2A activity in the mesenteric arteries of AngⅡ-induced hypertensive rats and the blocking effect of CAN. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAngⅡgroup.

图2 各组大鼠肠系膜动脉PP2A活性变化

Figure 3. The protein levels of PP2Ac and p-PP2Ac (Tyr307) in the mesenteric arteries of AngⅡ-induced hypertensive rats and the blocking effect of CAN. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAngⅡgroup.

图3 各组大鼠肠系膜动脉PP2Ac表达和PP2Ac Tyr307磷酸化水平

讨 论

肾素-血管紧张素系统激活是导致高血压的主要机制之一[14]，AngⅡ作为该系统中最为关键的血管活性物质，参与血流动力学和机体水钠平衡调节[2-3]。RAS长期激活，尤其是AngⅡ浓度增加可导致原发性高血压的发生[15]。在自发性高血压大鼠[16]和肾血管性高血压动物模型[17]中均存在RAS激活、血清和 (或) 组织中AngⅡ水平增高。本研究使用微量渗透泵持续灌注AngⅡ的方法复制高血压大鼠模型，并检测了各组血清中AngⅡ含量，观察到在持续灌注AngⅡ后，大鼠血清中AngⅡ含量显著升高，且血压升高超过术前30 mmHg以上，提示AngⅡ诱导的高血压大鼠模型复制成功。CAN灌胃治疗显著降低AngⅡ所致的高血压，表明在高血压形成过程中增高的AngⅡ通过与AT1R结合使血管发生收缩导致血压升高，给予CAN灌胃治疗可拮抗AT1R发挥显著降压作用。

血管内皮功能障碍是多种心血管疾病发病的共同始动因素，eNOS活性降低导致内皮细胞产生NO减少是引起内皮功能障碍的关键环节[18]。eNOS的活性调控涉及基因转录、蛋白质翻译和翻译后修饰等过程，磷酸化和去磷酸化调控是eNOS蛋白质翻译后修饰的重要机制之一，Ser1177位点磷酸化可显著上调eNOS活性[7]。AngⅡ是引起eNOS Ser1177降低的一个重要因素。已有研究表明，AngⅡ可下调人主动脉内皮细胞eNOS Ser1177磷酸化水平，减少NO的产生，其作用是通过AT1R通路所介导[19]。在动物整体水平研究中同样观察到，高盐性高血压大鼠主动脉eNOS Ser1177磷酸化水平下降，给予AT1R阻滞剂CAN治疗后显著增高eNOS Ser1177磷酸化水平，增加NO合成[20]；糖尿病小鼠主动脉eNOS Ser1177磷酸化水平下调，AT1R阻滞剂阿奇沙坦可上调eNOS Ser1177磷酸化水平，改善内皮功能[21]。本研究也观察到AngⅡ诱导的高血压大鼠肠系膜动脉eNOS Ser1177磷酸化水平显著下调，而CAN显著逆转该效应。这些均提示AngⅡ通过AT1R通路显著下调eNOS Ser1177的磷酸化水平，本文进一步研究其分子机制。

既往研究已证实，PP2A参与eNOS Ser1177去磷酸化调节[9-10]。在本课题组前期研究中已检测到2K1C高血压大鼠肠系膜动脉eNOS Ser1177发生去磷酸化、PP2A活性增高，是由AngⅡ/AT1R 通路介导[12]，继续用大鼠肠系膜动脉进行离体水平研究，显示20 nmol/L OA可显著抑制AngⅡ诱导的eNOS Ser1177下调，进一步验证了AngⅡ所介导的eNOS Ser1177下调是因PP2A的激活而引起[13]。本研究检测到AngⅡ诱导大鼠肠系膜动脉PP2A活性显著增高，通过分析PP2A活性与eNOS Ser1177磷酸化水平的相关性，结果表明二者呈负相关， 提示AngⅡ诱导的高血压大鼠肠系膜动脉eNOS Ser1177磷酸化水平下调也是由于AngⅡ/AT1R通路激活PP2A所致。