TGFβ1/Smad3信号通路介导的赖氨酸羟化酶2活性变化在肺纤维化胶原沉积中的作用*

邵松军， 方海燕， 叶贤伟， 饶姗姗， 张帮艳， 袁国航, 刘维佳△， 张湘燕△

(1贵州省人民医院呼吸与危重症医学科， 贵州省呼吸疾病研究所， 贵州 贵阳 550002； 2贵州省第二人民医院老年精神病科， 贵州 贵阳 550006)

肺纤维化(pulmonary fibrosis，PF)是不同病因导致的慢性间质性肺疾病(interstitial lung disease，ILD)的共同结局[1]。据欧洲呼吸病学杂志统计数据显示，其年发病率 6.8～16.3人/10万人口，年患病率14～42.7人/10万人口，65岁以上人群发病率93.7人/10万人口[2-3]。在我国虽没有明确的PF流行病学资料，但学者王柳盛等[4]发表的《中国大陆间质性肺疾病流行病学资料及研究进展》中提示，我国间质性肺疾病的患者也逐年增加。肺纤维化发病机制复杂，治疗方案也有限，5年生存率<50%[5]。目前治疗肺纤维化的药物有吡非尼酮和尼达尼布，但价格昂贵、副作用大，对肺纤维化的临床治疗效果欠佳[6-7]，因此，深入探讨肺纤维化的发病机制，寻找新的治疗靶点意义重大。

目前，转化生长因子β1(transforming growth factor-β1，TGFβ1)是公认最强的促纤维化因子，一方面可以促进成上皮细胞和纤维细胞增殖、转化及转分化；另一方面可以在转录或转录后水平调节胶原等细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的表达，并且抑制其降解[8]。然而，胶原代谢的经典研究认为胶原的合成增加主要由肺成纤维细胞增殖活化，纤维化病灶中胶原分子共价交联的形成，使得胶原难以降解而发生积聚[9-10]。在胶原形成中分子间交联是一个重要的翻译后修饰过程[11]。有文献报道，赖氨酸羟化酶与胶原交联关系密切，影响其形成和稳定[12]。赖氨酸羟化酶2(lysyl hydroxylase 2，LH2)被前胶原赖氨酸2-酮戊二酸5-加双氧酶2(procollagen-lysine 2-oxoglutarate 5-dioxygenase 2，PLOD2)基因编码，胶原分子吡啶交联增加与LH2有关[13]。而米诺地尔(minoxidil，Mi)是一种氮杂环乙烷嘧啶衍生物，之前主要用于降血压和促进毛发生长。最近发现其可通过对赖氨酸羟化酶竞争性抑制，有效地阻止胶原蛋白的翻译后修饰过程[14]。

目前尚不清楚LH2活性变化是否被TGFβ1/Smad3信号通路调节，LH2活性变化如何对胶原翻译后修饰进行调节，米诺地尔又是如何导致LH2活性变化的。因此，本次实验将从体外对上述问题进行研究，以期为肺纤维化的发病机制进一步提供新的理论依据和实践基础，将为其临床治疗提供新的思路和靶点。

材 料 和 方 法

1 细胞株及培养

人肺成纤维细胞株HFL1细胞购自广州吉尼欧生物科技有限公司。复苏HFL1细胞并接种于25 cm2培养瓶中，加4 mL含10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的F12培养基，并置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。细胞生长融合度为80%时，用0.25% 胰蛋白酶消化，隔天换液、传代，取生长状态较好的HFL1细胞进行后续实验。将HFL1细胞接种于6孔板，待融合度约为50%时随机分为3组：对照组(control group), 10% FBS+F12; TGFβ1刺激组(TGFβ1 group), 10% FBS+F12+10 μg/L TGFβ1;米诺地尔加TGFβ1组(Mi+TGFβ1 group), 10% FBS+TGFβ1+5 μmol/L Mi。各组常规培养48 h。

2 主要试剂

F12培养基和FBS均购自Gibco；米诺地尔购自Sigma；TGFβ1购自PeproTech；抗Smad3和p-Smad3抗体购自Cell Signaling Technology；抗α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)抗体购自Abcam；抗β-actin抗体购于博奥森公司；蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂混合物购自Kangchen；超敏ECL化学发光试剂盒购自Affinity；TRIzol试剂盒购自Invitrogen；Talent荧光定量检测试剂盒(SYBR Green)购自Tiangen；反转录试剂盒购自Thermo。

3 实验方法

3.1ELISA实验 收集经分组处理各时点的HFL1细胞，冰浴制备匀浆，对匀浆液进行超声破碎，5 000 r/min，离心10 min，取上清待测。室温平衡20 min后铝箔袋中取出所需的条板，剩余用自封袋密封放回4 ℃，设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50 μL，样本孔中加入待测样本50 μL；空白孔不加。除空白孔外，标准品孔和样本孔每孔加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体100 μL，用封板膜封住反应孔，37 ℃水浴锅或恒温箱温育60 min。弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液(350 μL)，静置1 min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次。每孔加入底物A、B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min，每孔加入终止液50 μL，15 min内，在450 nm波长处测定各孔的吸光度(A)值。

3.2Western blot实验 将3组细胞培养48 h后，用细胞裂解液(含PIPA裂解液、蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂混合物)提取总蛋白，制成蛋白样品后，SDS-PAGE电泳分离蛋白，转膜,封闭,孵育抗β-actin(1 ∶1 000)、LH2(1 ∶1 000)、α-SMA(1 ∶ 500)、胶原蛋白I(collagen I, COLⅠ;1 ∶500)、胶原蛋白IV(collagen IV，COL Ⅳ; 1 ∶500)、Smad3(1 ∶1 000)和p-Smad3(1 ∶500)抗体，4 ℃冰箱过夜。次日洗膜，室温孵育辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG(1 ∶6 000)和羊抗小鼠IgG(1 ∶6 000)，ECL显影液曝光，用Image Lab软件分析。

3.3RT-qPCR实验 将3组细胞培养48 h后收集到无RNA酶EP管中，根据TRIzol说明书上的步骤提取各组细胞的总RNA，然后按照反转录试剂盒说明书步骤将总RNA反转录为cDNA，之后联合引物按照荧光定量检测试剂盒说明书操作步骤进行RT-qPCR检测。检测目的基因的引物序列见表1。

表1 检测目的基因的引物序列

4 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计处理，实验数据以均数±标准差(mean±SD)表示，多组数据间比较用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间两两比较使用Bonferroni-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 各组HFL1细胞中羟基赖氨酰吡啶酚(hydroxylysylpyridinoline, HP)含量的变化

ELISA实验结果提示，经TGFβ1刺激后，细胞中HP含量较对照组明显增多(P<0.01)，但给予米诺地尔处理后其含量减少(P<0.05)，见图1。

Figure 1. The changes of hydroxylysylpyridinoline contents in each group of HFL1 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsTGFβ1 group.

图1 各组HFL1细胞中羟醛赖氨酰胶原吡啶链含量的变化

2 Western blot 检测结果

HFL1细胞经TGFβ1刺激后，与对照组比较，总Smad3蛋白水平无明显变化，p-Smad3、LH2、α-SMA、COLⅠ和COLⅣ的蛋白水平明显增加；给予米诺地尔干预后，总Smad3蛋白水平仍无明显变化，p-Smad3、LH2、α-SMA、COLⅠ和COLⅣ的蛋白水平减少(P<0.05)，见图2。

3 RT-qPCR实验结果

HFL1细胞经TGFβ1刺激后，PLOD2、COLⅠ和α-SMA的mRNA表达水平明显上调；经米诺地尔干预后，PLOD2、COLⅠ和α-SMA的mRNA表达水平下调(P<0.05)，其变化趋势与蛋白质的变化相一致，见图3。

讨 论

肺纤维化的特征性病理生理改变包括成纤维细胞增殖、活化，转分化为肌成纤维细胞，这种细胞可分泌大量胶原纤维沉积于细胞外基质。细胞蛋白水平的特征性改变主要包括：肌成纤维细胞的标志性蛋白α-SMA表达水平升高,肺脏主要以表达COL I、胶原蛋白III(collagen III, COL III)和COL Ⅳ增高为主[15]。

有学者研究报道致纤维化因子TGFβ1可通过激活TGFβ1/Smads信号通路导致肺纤维化[16]。TGFβ1/Smads信号通路中的Smads蛋白介导了TGFβ1的胞内信号转导，激活纤连蛋白(fibronectin，FN)和胶原等肺纤维化相关靶基因的转录[17]，使FN、COL I和COL III等细胞外基质蛋白表达增加，大量ECM沉积，使肺泡结构受到破坏，导致纤维化的发生发展。有研究报道，在骨关节炎患者的滑膜成纤维细胞中，TGFβ可诱导LH2b的表达，其表达增加导致胶原中吡啶链合成增多[18-19]。Gjaltema等[20]研究者分别利用致纤维化的细胞因子TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、TNFα、IL-4和activin A刺激人真皮成纤维细胞后，LH2b的mRNA表达上调，COL1A1的mRNA表达增加。Gjaltema等[21]在体外培养的人真皮成纤维细胞中的研究中发现，TGFβ1可上调PLOD2启动子的活性，促进PLOD2表达从而促使纤维化的发生，而这种现象在应用TGFβ1中和抗体后消失，提示TGFβ1是PLOD2表达的上游调控因子[22]。TGFβ1/Smads通路是纤维化发病机制中最经典和重要的信号通路之一，该通路下游重要的调控因子Smad3，在纤维化的发病机制中占有重要地位。那么是否该通路的激活是导致肺纤维化发生的机制？本实验体外培养人肺成纤维细胞，采用人重组TGFβ1因子刺激后，Smad3的活性增强，磷酸化蛋白水平升高，对TGFβ1信号通路转导作用增强，LH2的mRNA和蛋白表达水平较对照组明显增高，下游纤维化基因和蛋白表达增加，特别是羟基化形式的胶原吡啶合成增多，翻译后修饰的胶原合成增加，沉积细胞外基质，导致肺纤维化的发生。

Figure 2. The protein levels of LH2, Smad3, p-Smad3, α-SMA, COL I and COL Ⅳ in each group of HFL1 cells determined by Wes-tern blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsTGFβ1 group.

图2 Western blot检测不同条件下HFL1细胞中LH2、Smad3、p-Smad3、α-SMA、COL I和COL Ⅳ的蛋白水平

Figure 3. The mRNA expression of PLOD2, COLⅠ and α-SMA in each group of HFL1 cells detected by RT-qPCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsTGFβ1 group.

图3 各组HFL1细胞中PLOD2、COLⅠ和α-SMA的mRNA表达

文献报道，赖氨酸羟化酶是一种内质网膜结合蛋白，作为一类功能性蛋白质在人体组织中广泛表达，能催化前胶原分子螺旋区和端肽区的赖氨酸残基羟基化而影响胶原交联的形成[23]。分子间交联是胶原形成中的一个重要的翻译后修饰过程[11]。正常的肺组织中，胶原交联主要来自醛赖氨酸途径。但在纤维化的肺组织中，胶原分子间交联主导途径发生转化，即由醛赖氨酸途径向羟醛赖氨酸途径转化，导致羟基化的吡啶交联增加。有报道：在皮肤纤维化病变，如肥厚性瘢痕，瘢痕瘤，系统性硬化症和脂性硬皮病中观察到羟醛赖氨酸吡啶交联增加[9, 24-25]。在肝脏纤维化病灶如寄生虫性肝硬化、病毒性肝硬化、酒精性肝硬化和肾脏纤维化病变如肾小球硬化症中羟醛赖氨酸吡啶交联均增加[9-10]。在肺脏肿瘤基质中的研究发现，羟醛赖氨酸来源胶原吡啶交联增加[26]。在人滑膜骨关节成纤维细胞中研究发现，内源性TGFβ使滑膜LH2表达增加，引起LP和HP增加，导致胶原分子的总吡啶链增加[18]。在本实验中发现TGFβ1可通过激活Smad3信号通路，使LH2活性增强，基因和蛋白表达水平上调，羟基化的胶原吡啶合成增多。并诱导成纤维细胞向肌成纤维细胞转化(fibroblast-mesenchymal transition，FMT)，肌成纤维细胞可分泌大量的胶原，导致纤维化相关蛋白合成明显增多，这表明TGFβ1能诱导HFL1细胞发生FMT的过程，导致间质标志性标志物COL Ⅰ和α-SMA的mRNA和蛋白水平表达明显上调。然而米诺地尔通过抑制TGFβ1诱导的HFL1细胞向肌成纤维细胞转化这一过程，纤维化标志性蛋白表达水平下调，羟醛赖氨酰胶原吡啶链合成减少，细胞外基质蛋白胶原Ⅰ和胶原Ⅳ合成均减少，细胞外基质胶原沉积减少，阻碍了肺纤维化的发生发展。

本实验也还有很多不足之处，如米诺地尔如何干预信号通路的传导，从而影响下游赖氨酸羟化酶基因和蛋白的表达变化，细胞外基质胶原沉积是否还与基质金属蛋白酶及其组织抑制因子的表达变化有关，相关机制还需进一步研究阐明。