中药单体小檗碱靶向降解CML特征性蛋白BCR-ABL及其机制的研究*

费雲昊， 阴 钊， 丰茂晓， 刘燕君， 费 嘉

(暨南大学基础医学院生物化学与分子生物学系， 广东 广州 510632)

慢性粒细胞白血病(chronic myelogenous leukemia, CML)是一种造血系统恶性肿瘤，其特征表现为骨髓中的髓细胞不受调控地快速增殖，增殖的髓细胞在血液中积累[1]。费城染色体(Philadelphia chromosome, Ph)是CML的重要遗传标记，其来源于9号染色体上的ABL基因和22号染色体上的BCR基因相互融合[2]。22号染色体上的BCR基因在特定的断裂位点上断裂，与9号染色体上的ABL基因连接在一起，融合基因表达产生了BCR-ABL融合蛋白，具有很强的酪氨酸激酶活性，可以激活一系列肿瘤相关信号通路。因此目前针对CML的治疗都集中在BCR-ABL蛋白抑制剂的开发。

小檗碱(berberine)又称黄连素，是中药黄连的主要活性成分，是一种稳定存在的生物碱，广泛存在于如小檗科、毛莨科等多种植物当中，并易于获得[3]。许多研究证据表明盐酸小檗碱对痢疾杆菌、大肠杆菌和肺炎双球菌等多种细菌有抑制作用[4]。近来研究显示小檗碱在糖尿病[5]、降血脂治疗[6]、阿尔茨海默病[7]以及抗肿瘤[8]等方面具有很好的应用前景。小檗碱在血液系统肿瘤，如急性髓性白血病(acute myelogenous leukemia,AML)中表现出强的抗肿瘤细胞增殖活性[9]。小檗碱能诱导白血病细胞出现典型的细胞凋亡形态学变化，例如出现DNA规律性断裂，电泳呈现凋亡的典型条带变化。小檗碱还可以调控多种凋亡相关蛋白的表达，如上调促凋亡蛋白Bax和Bad的表达；下调Bcl-2等抗凋亡蛋白的水平[10]。小檗碱对CML细胞的研究已经有了一定的进展，但是小檗碱在CML中的靶标及其相关机制尚无报道。

中药是我国具特色和原创思想的物质财富。然而，长期以来中药研究只注重临床实践，而缺乏循证医学的直接实验证据，特别是药效物质和作用靶点不明确，因而难以深入揭示其治疗疾病的分子机理，严重制约了中药现代化和国际化。小檗碱是传统治疗痢疾杆菌的中药，在民间应用于治疗多种疾病，虽然疗效明确，但是其药理机制和分子靶点均不清楚。

为了解小檗碱在慢性粒细胞白血病细胞中的作用，本项工作鉴定了小檗碱在CML中的靶标就是CML的特征性蛋白BCR-ABL，探讨了小檗碱作用于BCR-ABL后对BCR-ABL蛋白表达量的影响，以及小檗碱降解BCR-ABL蛋白的机制。

材 料 和 方 法

1 主要试剂

人ABL1质粒合成于广州复能基因有限公司。小檗碱购自Sigma；BCR I抗购自Abcam;ABL1 I抗购自CST;GAPDH I抗购自CST；泛素化抗体[Anti-ubiquitin (FK2) antibody]购自Millipore；Protein A/G购自Santa Cruze。

2 主要方法

2.1细胞培养 BaF3-P210和BaF3-P210-T315I细胞株由重庆医科大学医学检验系临床血液学教研室冯文莉教授惠赠。BaF3-P210细胞中含有P210 BCR-ABL蛋白，是一种慢性粒细胞白血病细胞系的模型。BaF3-P210-T315细胞是一种BCR-ABL-T315I突变引起耐伊马替尼的细胞模型。293T-flag-BCR-ABL细胞是在293T细胞中转染flag-BCR-ABL质粒构建的过表达BCR-ABL蛋白的细胞。

2.2分子模拟对接实验 从蛋白质数据库(Protein Data Bank)中获得ABL1蛋白三维空间结构的PDB文件，包含：BCR-ABL蛋白 Protein Kinase区域(2ZQOH)；BCR-ABL蛋白(743 aa～1 028 aa)突变后的Protein Kinase区域(3IK3)； BCR-ABL蛋白SH2结构域(635 aa～746 aa，3K2M)。在药物数据库中获得小檗碱的三维空间结构PDB文件。从Discovery的官网上下载Dicovery Studio 4.5软件。将小檗碱和ABL1蛋白结构域的三维结构导入进入软件中，使用受体-配体结合模块，观察小檗碱与ABL1蛋白SH3-SH2、PTK和F-actin 结构域的结合情况。

2.3蛋白表达及纯化实验 将1 μL ABL1结构域质粒(SH3-SH2、PTK和F-actin)转化到Arctic Expression (DE3) 感受态细菌中，次日早晨挑取平板上的单克隆接种于含 50 mg/L 卡那霉素的4 mL LB 培养液的试管中， 37 ℃、220 r/min 振摇培养至下午13点，OD约0.6；按1 ∶250 比例，接种于含50 mg/L 卡那霉素的1 L LB 培养液中，37 ℃、220 r/min 振摇至菌体 OD 600 为 0.5～0.6 (约 3 h)；按照比例1 L 发酵培养基中加入诱导剂 IPTG 至终浓度为 0.1 mmol/L，220 r/min 16 ℃培养过夜； 5 000×g，5 min离心去上清收集发酵菌体，-20 ℃保存待破碎纯化。

超声破碎菌体破碎条件：350 W 功率，破碎 4 s，间隔 6 s，共 180 循环，破菌缓冲液：20 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，pH 8.0。 Ni-IMAC(5 mL) 纯化破碎后的菌体 12 000×g，离心20 min， 4 ℃，收集上清进行镍柱纯化，填料类型为 Ni-IMAC。平衡液配方为：20 mmol/L Tris, 500 mmol/L NaCl, pH 8.0，洗脱液：20 mmol/L Tris, 500 mmol/L NaCl, 500 mmol/L imidazole, pH 8.0。分别使用含有 20 mmol/L、50 mmol/L、200 mmol/L和500 mmol/L imidazole 的4种洗脱液进行洗脱，根据吸收峰值收集洗脱液，蛋白纯化出来后，进行表面等离子体共振成像(surface plasma resonance imaging,SPRi)实验。

2.4SPRi实验 将盐酸小檗碱点样在3D光交联芯片上，作为抗原，使用雷帕霉素作为芯片的阳性对照，将纯化出的蛋白作为流动相，进行流通，流通缓冲液为1×PBS (pH=7.4)，将SH3-SH2设置250、500、1 000和2 000 nmol/L共4个浓度梯度进行流通，PTK设置100、200、400和800 mmol/L共4个浓度梯度进行流通，F-actin设置100、200、400和800 nmol/L进行流通，流通物进样速度为2 μL/s，时间为300 s，反应在25 ℃的条件下进行，通过SPRi测定中药单体小檗碱与SH3-SH2等蛋白的动力学参数，分析其结合情况。

2.5Western blot实验 本实验分组为5 μmol(之前的实验结果得知)小檗碱处理CML细胞0、4、12和24 h(泛素化检测时间梯度设置为0、6、12、24和48 h)。取对数生长期的 BaF3-P210和BaF3-P210-T315I 细胞，以1×108/ L 的密度接种于6孔板，每孔4 mL，加入5 μmol的小檗碱处理不同的时间，收获细胞，PBS 洗涤 3 次，RIPA法提取蛋白，采用 BCA 蛋白定量法测定蛋白浓度。加入loading buffer进行蛋白变性。用SDS-PAGE进行蛋白分离，80 V 30 min，120 V 1 h。蛋白分离后 300 mA，1 h 20 min 转膜至 PVDF 膜上。室温下 5% 脱脂奶粉封闭膜 1 h，用相应的I抗 4 ℃孵育膜过夜，洗涤后换 HRP 标记II抗室温孵育 1 h。洗涤后使用化学发光试剂盒在ALLIANCE超灵敏化学发光成像仪显影，检测细胞中BCR-ABL的变化，以及泛素化水平的改变。

2.6免疫沉淀实验 本实验分组为：5 μmol小檗碱处理CML细胞48 h组;10 μmol MG132处理细胞48 h组；10 μmol MG132预处理细胞4 h后，加入5 μmol小檗碱处理细胞48 h组。蛋白提取步骤同上，每组蛋白提取液中加入5 μL IgG抗体(IgG抗体的种属与目的蛋白抗体的种属一致)，同时每管加入30 μL Protein A/G。放在旋转式摇床上，4 ℃摇匀30 min。摇匀结束后，将离心管放入低温离心机中。温度设为4 ℃，2 500×g离心5 min。收集上清到新的EP管中，每管再加入30 μL Protein A/G。放在旋转式摇床上，4 ℃摇匀30 min。摇匀结束后，将离心管放入低温离心机中。2 500×g离心5 min。收集上清到新的EP管中，使用Bradford蛋白浓度测定试剂盒的说明书测定蛋白浓度。之后，每1 mg蛋白加入2 μL BCR抗体，放在旋转式摇床上，4 ℃孵育过夜。第2天，每管中加入40 μL Protein A/G.。旋转式摇床上，4 ℃孵育4 h。孵育结束后，放入低温离心机中。温度设为4 ℃，2 500×g离心5 min。去上清，每管加入1 mL的PBS洗涤Protein A/G，4 ℃、2 500×g离心5 min。重复3次。每管加入40 μL 1×上样缓冲液，沸水中煮10 min。Western blot 上样量为5 μL。Western blot实验步骤同上。

3 统计学处理

数据处理使用SPSS统计软件，数据以均数±标准误(mean±SEM)表示，采用单因素方差分析法(one-way ANOVA)分析各组数据间差异的显著性，以P<0.05为有显著差异。

结 果

1 分子模拟对接预测小檗碱和慢性粒细胞白血病特征性蛋白BCR-ABL直接结合

Discovery Studio 4.1软件分子模拟对接结果显示，小檗碱可以直接和BCR-ABL蛋白羧基末端(1 519～1 644 aa)的F-actin连接区域(1ZZP)模拟对接，见图1A；BCR-ABL蛋白的Protein Kinase区域(2ZQOH)可以和小檗碱模拟对接，见图1B；BCR-ABL蛋白(743～1 028 aa)突变后的Protein Kinase区域(3IK3)可以和小檗碱模拟对接，见图1C； BCR-ABL蛋白SH2区域(635～746 aa，3K2M)也可以和小檗碱模拟对接，见图1D。

2 SPRi验证小檗碱可以直接和慢性粒细胞白血病特征性蛋白BCR-ABL结合

SPRi实验结果显示，小檗碱可以直接和ABL1的SH3-SH2、PTK及F-actin结构域结合，见图2。

3 小檗碱和BCR-ABL结合后会降解CML细胞内的BCR-ABL蛋白

小檗碱处理BaF3-P210和BaF3-P210-T315I细胞后，检测细胞中CML特征性蛋白BCR-ABL结果显示，随着5 μmol/L小檗碱处理时间的增加，相比于内参照β-actin蛋白，BCR-ABL蛋白表达显著降低(P<0.05)，见图3。

4 小檗碱通过促进BCR-ABL蛋白的泛素化水平降解BCR-ABL蛋白

小檗碱处理293T-flag-BCR-ABL细胞后检测细胞中整体泛素化水平及BCR-ABL蛋白泛素化水平，结果显示，随着小檗碱处理时间增加，小檗碱促进293T-flag-BCR-ABL细胞中整体的泛素化水平，见图4A, 促进293T-flag-BCR-ABL细胞中BCR-ABL蛋白的泛素化水平，见图4B。

讨 论

近年来传统中药单体小檗碱在白血病细胞中的药理作用日益受到重视。有研究报道，小檗碱可以通过抑制周期蛋白B1，同时促进Wee1蛋白的表达，引起白血病细胞的周期阻断[11]。小檗碱在控制白血病细胞的侵袭和迁移的能中起到重要的作用[12]。小檗碱对白血病治疗的研究已经进行了很久，但是小檗碱在白血病中的靶标及其作用机制尚不清楚。

Figure 1. The molecular docking simulation of berberine with BCR-ABL. A: berberine bound with the F-actin (1ZZP) domain of BCR-ABL; B: berberine bound with the PTK (2ZQOH) domain of BCR-ABL; C: berberine bound with the PTK mutation (3IK3) domain of BCR-ABL; D: berberine bound with the SH2 (3K2M) domain of BCR-ABL.

图1 小檗碱和BCR-ABL进行分子模拟对接

慢性粒细胞白血病的患者经过伊马替尼治疗后的复发，大多涉及到BCR-ABL融合蛋白的ABL激酶区域的突变。突变的ABL激酶区空间结构发生了改变，对于伊马替尼这种根据BCR-ABL激酶区域特定位点设计的药物就无法结合到该区域，无法阻止激酶的活性，即产生耐药性导致临床治疗失败。有报道显示，中药砷类化合物(As2O3和As4S4)已经用于治疗慢性粒细胞白血病。先前研究发现，砷类化合物和伊马替尼可以引起CML细胞的凋亡[13]。也有研究表明，砷类化合物可以与BCR-ABL蛋白泛素化位点结合，引起CML中BCR-ABL蛋白的泛素化降解途径，而非仅仅是抑制BCR-ABL的活性，这为我们的研究提供了新的思路[12]。有研究报道，小檗碱同样也引起K562细胞生长抑制，之前我们的研究也表明，小檗碱具有明显的抗CML的作用，但是小檗碱究竟是通过何种机制来产生这种作用尚未见报道，BCR-ABL融合蛋白的ABL区域具有4个结构域，分别是SH3、 SH2、 F-actin和PTK，这4个结构域均已经被解析，我们从Protein Data Bank数据库下载该结构域，并使用Discovery Studio软件进行分子模拟对接，检测到小檗碱在CML中的直接靶标就是CML特征性蛋白BCR-ABL，我们对小檗碱作用后慢性粒细胞白血病特征性蛋白BCR-BAL进行检测，发现小檗碱可以降低BaF3-P210-T315I细胞和BaF3-P210细胞中BCR-ABL蛋白表达量。进一步实验观察小檗碱与BCR-ABL蛋白的对接处序列中发现赖氨酸存在，提示泛素化位点的存在。因此我们检测了小檗碱作用后细胞中的泛素化水平并通过免疫沉淀的方法检测了小檗碱作用前后细胞中BCR-ABL蛋白的泛素化水平。结果显示小檗碱可以促进细胞中BCR-ABL蛋白的泛素化，这可能是小檗碱降解BCR-ABL蛋白的作用机制。

Figure 2. The SPRi between berberine and the domain of ABL1. A: the positive control of microarray; B: the specific binding curves of the concentration gradient of SH3-SH2 in berberine microarray; C: the specific binding curves of the concentration gradient of PTK in berberine microarray; D: the specific binding curves of the concentration gradient of F-actin in berberine microarray.

图2 表面等离子体共振成像实验验证小檗碱和ABL1蛋白的结构域结合

Figure 3. The expression level of BCR-ABL in BaF3-P210 and BaF3-P210-T315I cells. Mean±SEM.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 h group.

图3 小檗碱处理BaF3-P210和BaF3-P210-T315I细胞后BCR-ABL蛋白表达水平的变化

Figure 4. The ubiquitination of the cells and BCR-ABL protein after berberine (BBR) treatment. A: the overall ubiquitination level of 293T-flag-BCR-ABL cells after BBR treatment; B: the ubiquitination of BCR-ABL after BBR treatment in 293T-flag-BCR-ABL cells.

图4 小檗碱处理后细胞中整体的泛素化水平及BCR-ABL蛋白的泛素化水平

综上所述，小檗碱在CML中的靶标是CML特征性蛋白BCR-ABL,小檗碱可以促进细胞中BCR-ABL蛋白的降解，而且是通过泛素化途径降解BCR-ABL蛋白的。