超声提取-液相色谱法检测黑米中花青素

□ 晏晓清 张艳芳 陈 芩 朱晓玲 章 剑 黄冈大别山检测认证有限公司

黑米的颜色来源于沉积在种皮上的天然色素花青素（黑米色素），黑米色素是黑米营养价值所在[1-3]。黑米色素易溶于水、乙醇等极性大的溶剂，难溶于油脂等非极性溶剂，因而大多文献报道的黑米色素提取溶剂为甲醇、乙醇等极性溶剂。黑米中黑米色素最常见的提取鉴定方法是乙醇溶液萃取、紫外分光光度计法[4-6]。本实验意在建立超声波提取、高效液相色谱法检测黑米中花青素含量的方法。

1 材料与方法

1.1 仪器设备与主要试剂

AS10200T-10L超声波清洗器（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；L C-1200液相色谱（安捷伦科技公司）；BSA224S-CW电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；原花青素（含量≥95%，成都曼思特生物科技有限公司）；无水乙醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；石油醚（分析纯，30～60 ℃，天津市天力化学试剂有限公司）；乙酸乙酯（分析纯，天津市天力化学试剂有限公司）。

1.2 试验方法和测定方法

原料（黑米）→研磨过50目筛→黑米粉→加入乙醇（乙醇浓度65%，料液比1∶7，pH值为5.0）→超声提取（提取时间10 min；超声提取温度55 ℃；超声波功率300 W）→脱脂（加水10 mL、石油醚20 mL超声10 min，用一次性吸管除去上层清液，脱去黑米中的脂肪）→乙酸乙酯20 mL超声10 min→过滤待上机。

色谱条件：液相色谱带二极管阵列检测器，色谱柱为C18色谱柱，检测波长220 nm。流动相：水+甲酸+乙腈（5+75+20）。进样量10 μL；流速1 mL/min；柱温30 ℃。

2 黑米色素结果与分析

2.1 料液比对花青素提取率的影响

称取5份5.000 g黑米粉于比色管中，分别按料液比1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10加入75%的乙醇，60 ℃、5 min，300 W超声提取，提取液脱脂、除杂、过滤、上机。

从图1可知 ，1∶6～1∶ 7时随浸提溶剂增加，花青素浓度增加；1∶7～1∶9时随浸提溶剂增加，花青素浓度下降；料液比1∶9～1∶10时随浸提溶剂增加，花青素浓度又有所增加。料液比从1∶6到1∶10，花青素的浓度呈波浪型。1∶7时花青素浓度达到最大值。故选择1∶7为最佳料液比。

2.2 乙醇浓度对花青素提取率的影响

称取5份5.000 g黑米粉于比色管中，按料液比1∶8分别加入浓度为65%、70%、75%、80%、85%的 乙醇，60 ℃、5 min，300 W超声提取，提取液脱脂、除杂、过滤、上机。结果如图2所示。

图1 料液比对花青素浓度的影响

图 2 乙醇浓度对花青素浓度的影响

从图2可知，随乙醇浓度的增加，提取液中花青素浓度也逐渐增加，当乙醇浓度达65%，出现峰值。故选择65%乙醇为最佳提取剂。

2.3 超声提取温度对花青素提取率的影响

称取5份5.000 g黑米粉于比色管中，按料液比1∶8加入浓度为75%的乙醇，超声提取温度分别设为45、50、55、60、65 ℃，300 W超声5 min，提取液脱脂、除杂、过滤、上机。结果如图3所示。

图3 超声提取温度对花青素浓度的影响

从图3可知，随着提取温度的升高，花青素提取率呈先上升后下降的趋势。故选择55 ℃为最佳提取温度。

2.4 超声提取时间对花青素提取率的影响

称取5份5.000 g黑米粉于比色管中，按料液比1∶8加入浓度为75%的乙醇，超声提取时间分别设为3、5、6、8、10、11 min，60 ℃、300 W超声提取，提取液脱脂、除杂、过滤、上机。结果如图4所示。

从图4可知，超声提取时间延长，提取液中花青素浓度增大。3～6 min，浓度增加明显；6～11 min时平缓。10 min达峰值，故选择10 min为最佳提取时间。

图4 超声提取时间对花青素浓度的影响

2.5 黑米色素提取的正交试验

在单因素试验的基础上，考察料液比、乙醇浓度、超声提取温度、超声提取时间对花青素提取率的影响。进行L9(34) 正交试验（见表1），以提取液中花青素的浓度为评价指标，确定黑米中花青素提取的最佳工艺条件。

结果（表2）表明，影响黑米色素提取浓度的因素顺序为：D＞A＞B＞C，即超声提取时间对花青素提取的影响最大，其次为料液比，再次为乙醇浓度，影响最小的是超声提取温度。当浸提溶剂为乙醇时，超声波辅助提取黑米花青素的最优组合为：A2B1C2D3，即正交实验得出的最佳提取工艺条件料液比为1∶8，乙醇浓度为65%，超声温度为55 ℃，超声提取时间为10 min。

表 1 黑米中花青素的提取工艺条件正交实验表

表 2 正交实验结果分析表

3 结论

本实验以黑米为原料，采用超声波辅助提取，液相色谱法定量分析。单因素实验分析了提取过程中超声波功率、料液比、乙醇浓度、超声时间、超声温度及pH对黑米中花青素提取率的影响。在此基础上，采用L9(34)正交试验获得了黑米中花青素提取的最佳工艺条件：料液比1∶7，乙醇浓度为65%，超声提取时间为10 min，超声提取温度为55 ℃，pH值为5.0，超声波功率为300 W。

根据市场购买大米检测结果，花青素大量存在于黑米中，极少量存在于普通大米中，可作为评判掺假黑米的特征指标。本实验为建立更加准确成熟的真假黑米检测方法提供了依据。