5-羟色胺对肺动脉平滑肌细胞瞬时受体电位通道/活化T细胞核因子蛋白表达的影响▲

韩俊丽 田红燕 刘 亚 范粉灵

(1 西安交通大学第二附属医院重症医学科，陕西省西安市 710004，电子邮箱:lijunhan78@163.com；西安交通大学第一附属医院2 周围血管科，3 呼吸科，陕西省西安市 710061)

肺高压疾病是一组肺血管疾病的集合，这些疾病有一个共同特点，即用右心导管测量静息时的平均肺动脉压高于25 mmHg[1]。肺动脉高压属于肺高压疾病中的一类[2]，其预后差，发生机制复杂，许多研究证实血管收缩分子和血管舒张分子之间，以及促增殖分子和抑制增殖分子之间存在不平衡，导致肺动脉内皮细胞功能失调和平滑肌细胞增殖从而引起肺动脉高压[1，3]。5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)也称血清素，是一种重要的血管收缩物质和神经递质。5-HT假说于20世纪90年代提出，当时有学者观察到一些原发性肺动脉高压患者血浆5-HT水平升高；此外，减肥药诱发的肺动脉高压被认为与其间接的5-HT能效应有关[4]。因此5-HT与肺动脉高压的发生发展有密切关系，但具体的机制需进一步研究。本研究探讨5-HT及5-HT2A受体拮抗剂对肺动脉平滑肌细胞瞬时受体电位通道(transient receptor potential channel,TRPC)/活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cell,NFAT)蛋白表达的影响，以期为肺动脉高压的机制研究提供更多参考依据。

1 材料和方法

1.1 主要试剂与仪器 胎牛血清购自兰州民海生物工程有限公司，高糖杜氏改良伊格尔培养基(Dulbecco′s modified Eagle medium,DMEM)购自Thermo Scientific公司，5-HT、5-HT2A受体拮抗剂酮色林、TRPC抑制剂SKF96365购自Tocris公司(批号：3547、0908、1147)， TRPC1抗体、TRPC6抗体购自Alomone公司(批号：ACC-010、ACC-017)，NFATc3抗体购自Santa Cruz公司(批号：sc-8321)，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)单抗购自Epitomics公司(批号：2251-1)，辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的羊抗兔多克隆抗体购自Abcam公司(批号：ab6721)。ChemiDocTMXRS型凝胶成像系统购自Bio-Rad公司。

1.2 细胞培养和干预 人肺动脉平滑肌细胞购于美国模式培养物集存库(货号为 PCS-100-023TM)。将细胞置于含20%胎牛血清的高糖DMEM培养基于5% CO2、温度为37℃的培养箱中培养。培养至亚融合状态，更换为无血清高糖培养基，继续培养24 h后换为含0.2%胎牛血清的DMEM培养基。分3种方法干预24 h，每种干预方法设5个浓度梯度及对照组。3种干预方法分别为：(1)5-HT，设浓度梯度为0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L、33 μmol/L、100 μmol/L；对照组不加5-HT。(2)5-HT+酮色林，其中5-HT设为10 μmol/L，酮色林设浓度梯度为0.01 μmol/L、0.1 μmol/L、1 μmol/L、3.3 μmol/L、10 μmol/L；对照组只加10 μmol/L 5-HT，不加酮色林。(3)5-HT+SKF96365,其中5-HT设为10 μmol/L，SKF96365设浓度梯度为0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L、33 μmol/L、100 μmol/L；对照组只加10 μmol/L 5-HT，不加SKF96365。

1.3 蛋白免疫印迹法测定TRPC1、TRPC6及NFATc3蛋白表达情况 培养皿中加入十二烷基硫酸钠裂解液，用细胞刮刀收获细胞，离心，提取肺动脉平滑肌细胞蛋白，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白后，将蛋白转印至硝酸纤维素膜。5%脱脂奶粉室温慢摇封闭1 h。加一抗(TRPC1抗体1 ∶200,TRPC6抗体1 ∶200,NFATc3抗体1 ∶100,GAPDH单抗1 ∶1 000)孵育过夜。TBST洗涤后加二抗(HRP标记的羊抗兔多克隆抗体,1 ∶5 000)室温慢摇孵育1 h。TBST洗涤后，用化学发光法于凝胶成像系统成像。Quantity One软件进行图像分析。每组3个样本，每个样本重复3次。

1.4 统计学分析 应用SPSS 13.0软件进行统计分析。计量资料以(x±s)表示，组间比较采用方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同浓度5-HT对肺动脉平滑肌细胞TRPC1、TRPC6和NFATc3蛋白表达水平的影响 与对照组相比，10 μmol/L、33 μmol/L、100 μmol/L 5-HT组TRPC1、TRPC6、NFATc3蛋白表达水平均升高(均P<0.05)；与0.1 μmol/L 5-HT组相比，33 μmol/L、100 μmol/L 5-HT组TRPC1、TRPC6、NFATc3蛋白表达水平均升高(均P<0.05)，10 μmol/L 5-HT组NFATc3蛋白表达水平升高(P<0.05)；与1 μmol/L 5-HT组相比，10 μmol/L、33 μmol/L 5-HT组NFATc3蛋白表达水平均升高，100 μmol/L 5-HT组TRPC6及NFATc3蛋白表达水平均升高(均P<0.05)；与10 μmol/L 5-HT组相比，100 μmol/L 5-HT组NFATc3蛋白表达水平升高(P<0.05)。见表1及图1。

表1 不同浓度5-HT作用下肺动脉平滑肌细胞TRPC1、TRPC6、NFATc3蛋白相对表达水平比较(x±s)

注：与对照组比较，*P<0.05；与0.1 μmol/L 5-HT组比较，#P<0.05；与1 μmol/L 5-HT组比较，aP<0.05；与10 μmol/L 5-HT组比较，bP<0.05。

图1 不同浓度5-HT对肺动脉平滑肌细胞TRPC1、TRPC6和NFATc3蛋白表达水平的影响

2.2 不同浓度酮色林对5-HT作用下肺动脉平滑肌细胞TRPC1、TRPC6和NFATc3蛋白表达水平的影响 与对照组比较，0.01 μmol/L酮色林+5-HT组TRPC6蛋白表达水平降低，1 μmol/L酮色林+5-HT组、3.3 μmol/L酮色林+5-HT组、10 μmol/L酮色林+5-HT组的TRPC6及NFATc3蛋白表达水平均降低(均P<0.05)；与0.01 μmol/L酮色林+5-HT组比较，10 μmol/L酮色林+5-HT组的NFATc3蛋白表达水平降低(P<0.05)；与0.1 μmol/L酮色林+5-HT组比较，1 μmol/L酮色林+10 μmol/L 5-HT组、3.3 μmol/L酮色林+5-HT组、10 μmol/L酮色林+5-HT组的TRPC6蛋白表达水平均降低(均P<0.05)。见表2及图2。

表2 不同浓度酮色林对5-HT作用下肺动脉平滑肌细胞TRPC1、TRPC6、NFATc3蛋白相对表达水平的影响(x±s)

注：与对照组比较，*P<0.05；与0.01 μmol/L酮色林+5-HT组比较，#P<0.05；与0.1 μmol/L酮色林+5-HT组比较，aP<0.05。

图2 不同浓度5-HT2A受体拮抗剂酮色林对5-HT作用下肺动脉平滑肌细胞TRPC1、TRPC6和NFATc3蛋白表达水平的影响

2.3 不同浓度SKF96365对5-HT作用下肺动脉平滑肌细胞TRPC1、TRPC6和NFATc3蛋白表达水平的影响 与对照组比较，10 μmol/L SKF96365+5-HT组、33 μmol/L SKF96365+5-HT组、100 μmol/L SKF96365+5-HT组TRPC6、NFATc3蛋白相对表达水平均降低(均P<0.05)；与0.1 μmol/L SKF96365+5-HT组比较，其余浓度SKF96365+5-HT组TRPC6蛋白相对表达水平均降低，且33 μmol/L SKF96365+5-HT组、100 μmol/L SKF96365+5-HT组NFATc3蛋白相对表达水平均降低(均P<0.05)；与1 μmol/L SKF96365+5-HT组比较，33 μmol/L SKF96365+5-HT组、100 μmol/L SKF96365+5-HT组TRPC6、NFATc3蛋白相对表达水平均降低(均P<0.05)。见表3及图3。

表3 不同浓度SKF96365对5-HT作用下肺动脉平滑肌细胞TRPC1、TRPC6、NFATc3蛋白相对表达水平比较(x±s)

注：与对照组比较，*P<0.05；与0.1 μmol/L SKF96365+5-HT比较，#P<0.05；与1 μmol/L SKF96365+5-HT比较，aP<0.05。

图3 不同浓度SKF96365对5-HT作用下TRPC1、TRPC6和NFATc3蛋白表达水平的影响

3 讨 论

肺动脉高压的组织学改变特点是远端肺动脉壁内呈现广泛的血管重塑，而肺动脉平滑肌细胞增殖是血管重塑的主要表现之一[1，5]。血管活性物质和相关信号通路是肺动脉高压研究的热点之一，许多血管活性物质参与调节肺血管收缩以及肺动脉平滑肌细胞增殖过程，例如内皮素-1、血小板衍生生长因子、血管生成素、成纤维细胞生长因子等。血管舒张因子与血管收缩因子之间的失衡被认为是肺动脉高压发生发展的始动环节[6]。5-HT是一种血管收缩物质和神经递质，也是血管平滑肌细胞的有丝分裂原，其还参与肺动脉高压进展过程中肺动脉平滑肌细胞的增殖和重塑[6]。5-HT通过5-HT受体和转运体进入细胞内发挥作用[4]。而5-HT2A受体与心血管系统关系密切，在平滑肌细胞和血小板中都有分布[7]。有学者通过高效液相色谱、放射酶学测定证实肺动脉高压患者血浆中的5-HT浓度明显高于正常人[8-9]。

TRPC和NFAT都是参与调节细胞内钙离子水平和细胞增殖的重要分子[10-11]。TRPC是细胞内重要的非电压门控的钙离子通道，其有7个亚型，分别为TRPC1～7[10]。TRPC在钙离子信号通路调节过程中起重要作用[10]，而钙离子参与调控细胞增殖、血管收缩等病理生理过程[12]。在血管平滑肌细胞中最常检测到的TRPC亚型有TRPC1、TRPC4、TRPC6[10]。许多研究证实TRPC与肺动脉高压的发生发展关系密切。其中，Yu等[13]发现，在特发性肺高压患者的肺组织和肺动脉平滑肌细胞中，TRPC3、TRPC6的mRNA和蛋白表达较正常压力或继发肺高压患者的升高，用小干扰RNA抑制TRPC6表达可显著降低特发性肺高压的肺动脉平滑肌细胞增生。肺动脉高压动物模型中也存在TRPC1、TRPC6等表达增高的现象[10]。NFAT可调节细胞的生长、凋亡等多种过程，参与心血管疾病、癌症等疾病的发生发展。NFAT有5个类型，分别为NFATc1～c5，而参与肺动脉高压病理生理过程的主要有NFATc1、NFATc2、NFATc3，三者在炎症、肺动脉平滑肌细胞增殖、代谢异常等过程中发挥作用[14]。在成年小鼠中，NFATc3的激活可增加肺动脉壁厚度；NFATc3缺陷的成年小鼠在缺氧条件下右室压在正常水平；慢性缺氧条件下，在新生小鼠肺动脉平滑肌细胞中观察到NFATc3的核积聚现象[14]。因此本研究观察了5-HT对肺动脉平滑肌细胞TRPC1、TRPC6和NFATc3蛋白表达的影响。结果显示，与对照组相比，10 μmol/L、33 μmol/L、100 μmol/L 5-HT组TRPC1、TRPC6、NFATc3蛋白表达水平均升高(均P<0.05)；但10～100 μmol/L的5-HT浓度组中，除了100 μmol/L 5-HT组NFATc3蛋白表达水平高于10 μmol/L 5-HT组(均P<0.05)，其他不同浓度组间的TRPC1、TRPC6、NFATc3蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。这提示10～100 μmol/L的5-HT可上调肺动脉平滑肌细胞TRPC1、TRPC6和NFATc3蛋白表达，但在该浓度范围5-HT对以上蛋白的上调作用并无显著的浓度依赖性。

我们进一步观察5-HT2A受体拮抗剂酮色林对5-HT干预作用的影响。结果显示，与对照组比较，0.01 μmol/L酮色林+5-HT组TRPC6蛋白表达水平降低，1 μmol/L酮色林+5-HT组、3.3 μmol/L酮色林+5-HT组、10 μmol/L酮色林+5-HT组的 TRPC6及NFATc3蛋白表达水平均降低(均P<0.05)，提示浓度为0.01 μmol/L、1～10 μmol/L的5-HT2A受体拮抗剂酮色林，可抑制5-HT上调肺动脉平滑肌细TRPC6蛋白表达的作用。许多研究表明5-HT可引起肺动脉平滑肌细胞内钙离子增加，而使用L型钙通道(电压门控钙通道)阻断剂并不能抑制5-HT引起的钙离子变化[15-16]。在心肌细胞中，非电压门控的钙离子通道TRPC1参与了5-HT活化钙调神经磷酸酶/NFAT的过程[17]。本研究还观察了TRPC通道抑制剂SKF96365对5-HT作用下肺动脉平滑肌细胞TRPC1、TRPC6和NFATc3蛋白表达的影响。结果显示，与对照组比较，10 μmol/L SKF96365+5-HT组、33 μmol/L SKF96365+5-HT组、100 μmol/L SKF96365+5-HT组TRPC6、NFATc3蛋白相对表达水平均降低(均P<0.05)。这表明10～100 μmol/L的TRPC通道抑制剂SKF96365可以抑制5-HT上调肺动脉平滑肌细胞TRPC6、NFATc3蛋白表达的作用。因此我们推测5-HT可能与TRPC通道存在联系，其可能通过直接参与调节TRPC通道，促进肺动脉平滑肌细胞增殖和肺动脉高压的发生发展。目前关于5-HT与TRPC通道及相关信号通路之间的作用研究较少，值得进一步研究。但是，1～10 μmol/L酮色林以及10～100 μmol/L SKF96365，对TRPC6及NFATc3蛋白表达水平的影响差异并无统计学意义(P>0.05)，提示在一定范围内提高酮色林、SKF96365的干预浓度可能并不能增强其作用效果，但这有待进一步的实验研究来验证。

综上所述，5-HT可上调肺动脉平滑肌细胞TRPC1、TRPC6和NFATc3蛋白表达，而5-HT2A受体拮抗剂酮色林和TRPC通道抑制剂SKF96365可抑制5-HT对肺动脉平滑肌细胞TRPC6和NFATc3蛋白表达的影响。5-HT与TRPC通道及相关信号通路之间的作用值得进一步深入研究，有可能成为肺动脉高压新的治疗靶点。