互叶白千层粤北引种资源的表型评价

谢佩吾 曾庆团 白青松 陈一群 陈杰连 连辉明 何波祥 张 谦

( 1. 广东省林业科学研究院广东省森林培育与保护利用重点实验室，广东 广州 510520；2. 广东省天井山林场，广东 韶关 512726)

互叶白千层（Melaleuca alternifolia），又名茶树，原产于澳大利亚新南威尔士和昆士兰，是桃金娘科（Myrtaceae）多年生木本植物[1-2]。因其叶片所含萜烯物质的不同，共分为6种化学型，其中3种为典型类型：4-松油醇型、1,8-桉叶油素型和异松油烯型，另外3种为杂合中间类型[2-3]。4-松油醇型精油价值最高，且3年生后每年可采收枝叶提取精油，开发潜力最大[4]。研究显示，4-松油醇型茶树油具有显著的抗真菌和抗细菌功效，并且对皮肤肿瘤具有明显抑制作用，已广泛用于生产个人护理产品，并在室内清洁、农业生产和医疗等方面开发了系列产品[5-6]。

互叶白千层种源与单株间的精油含量和品质存在显著差异[7]，选育叶片中4-松油醇含量高且1,8-桉叶油素和柠檬烯含量低的品系，是当前育种工作的主要目标[2]。澳大利亚于1993年启动了互叶白千层良种选育研究，历经4轮选育，将精油产量由最初的148 kg/hm2提高到250 kg/hm2[4,8]。精油中4-松油醇占比稳定在35.0%以上，最高可达48.0%，1,8-桉叶油素占比控制在10.0%以内，柠檬烯含量保持在安全水平的0.5%～1.5%[9]。

我国于20世纪90年开始互叶白千层引种试验，目前已在广东、广西、福建等地建立了规模化种植基地，引种资源生长性状以及精油产量与品质多呈现出良好的适应性[10-12]。鉴于种植苗木多为澳大利亚引进的商业化种子苗，其种质资源遗传背景与遗传丰富度不清晰，用于良种选育的潜力不明确，加上我国对互叶白千层选育研究的投入长期不足，致使我国在新种质创制研究领域远落后于澳大利亚。近年来，受澳大利亚优质资源出口限制，我国互叶白千层种质资源面临掣肘，林地经济效益不能实现最大化，严重阻碍了我国茶树油产业发展，迫切需要系统开展良种选育研究，培育一批具有自主知识产权的优异新品系，冲破国外对优质资源的垄断和限制。为此，本研究以从澳大利亚引进的4-松油醇型互叶白千层种子园混合子代为材料，系统开展生长性状、精油含量与有效成分的精准分析，从中筛选出一批表型优异的单株，为今后新种质创制研究储备战略遗传资源。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选择2012年12月从澳大利亚茶树油产业协会（ATTIA）引进的一批4-松油醇型互叶白千层种子园混合种子[4]，并于2013年2月人工播种育苗，共计繁育苗木10万株。2014年3月，采用随机混交种植的方式，在广东省韶关市乳源瑶族自治县太阳镇营建互叶白千层人工林，种植密度为6 000株/hm2，最终建成互叶白千层的粤北资源林。试验地海拔280～410 m，地势较平坦，坡度小于3°。土壤为花岗岩风化的红壤，土层厚超过90 cm，腐殖土超过12 cm。年平均气温15.8 °C，年降雨量1 170.5 mm，年日照时数为2 002 h。

1.2 待测单株选择

鉴于试验林谱系不清晰，课题组模仿天然林选优的方法[13-14]，于2017年12月采用随机选择的方式，在4年生试验林中选择立地条件基本一致的区域挑选211株待测单株。为了提高选择群体的遗传丰富度，两两入选单株之间的距离不小于25 m。

1.3 指标测定

1.3.1 单株生物量测定

选定待测单株后，测定树高（m）、胸径（cm）、纵向和横向冠层宽（m），并依据纵向和横向冠层宽计算树冠截面积（m2），计算公式为：

1.3.2 单株精油提炼

在待测单株树冠西侧向下1/2处采集同等成熟度的枝叶，用塑料袋密封后带回实验室，4 °C冰箱保存。鲜叶精油提炼采用隔水蒸馏法[15]。首先将采集的枝叶进行分拣，剔除直径2 mm以上的枝条，保留新鲜叶片，精准称量700 g，装入10 L自制圆柱状蒸馏钢瓶，鲜叶与钢瓶底部保留2 L隔离区，满足隔水蒸馏鲜叶精油的需要；随后在蒸馏钢瓶上安装挥发油测定器和冷凝管，加热蒸馏到挥发油不再增加时，停止加热，冷却到室温；最后分离精油，称量并计算鲜叶含油量（g/kg）。

与警察高校而言，独立设课后的实验教学学时数应有理有据，合理安排，尤其如犯罪现场勘查、痕迹检验、交通事故处置等实践应用性强的专业课程，其实验教学学时应调整为原总学时（原课堂理论教学学时与原教学实验学时之和）的40～50%。没有必须的实验教学学时作保障，警察高校应用型专业人才培养目标就难以实现。

1.3.3 化学成分分析

依据全部测定单株鲜叶含油量，按从高到低排序，挑选含油量前166名的茶树油为样品，采用气-质联用法进行精油化学成分定性和定量分析。分析参照的标准为国际标准ISO4730—2017，组分含量用气相色谱的面积归一法确定[3]。另外，依据鲜叶含油量与精油中4-松油醇占比，计算鲜叶4-松油醇含量（g/kg）。

1.4 数据分析

选用Excel 2016整理原始数据，采用SAS 9.4软件进行数据统计分析。计算生长性状、鲜叶含油量和主要化学成分的均值、中位数、标准误、最大值、最小值和变异系数[13]。采用主成分分析法，计算树高、胸径、树冠截面积、鲜叶含油量、4-松油醇占比共5个性状的综合变量及分量[13]，并求出权重[16]。优良单株筛选采用综合选择指数法[14]，计算公式如下：

式中：IC为综合选择指数；为了避免选择结果受目标性状观测值数量级的影响，5个性状采用群体校对均值与单株观测值比值的百分数；字母a，b，c，d和e为5个性状的权重。

2 结果与分析

2.1 生长性状与化学成分分析

图1列出了互叶白千层测定单株9个目标性状的统计值。在生长量方面，4年生单株的平均树高、胸径和树冠截面积分别为5.92 m、7.09 cm和2.07 m2，其变异系数分别达到15.38%、16.66%和44.74%，说明互叶白千层测定单株生长性状具有中等和较高程度的遗传分化，具有可观的遗传选育潜力。

图1 互叶白千层测定群体9个性状的数据分布Fig. 1 Data distribution graph of 9 traits for studied M. alternifolia population

测定鲜叶精油含量发现，211株测定样品的鲜叶平均含油量为10.27 g/kg，其中位数为10.21 g/kg，鲜叶最低和最高含油量分别为5.01 g/kg和17.01 g/kg，变异系数达到18.44%，说明引种资源的鲜叶含油量亦具有较丰富的遗传分化。

精油化学成分分析结果显示，各单株精油中1,8-桉叶油素、异松油烯、4-松油醇和柠檬烯占比差异较大，表明不同单株精油的有效成分含量与品质存在明显差异。主要化学成分4-松油醇占比较高，达到29.90%～48.67%，占比均值与中位数分别为40.26%和40.56%，说明绝大部分单株4-松油醇占比达到国际标准ISO4730—2017[9]规定的35%～48%的要求；单株间4-松油醇占比变异系数较低，仅为8.81%，说明单株间4-松油醇占比稳定在一个较高水平。

精油（茶树油）品质方面，1,8-桉叶油素占比平均值为3.00%，但单株间差异明显，在0.19%～9.19%之间，变异系数高达50.80%；对比国际标准发现，全部单株的1,8-桉叶油素占比处于≤10%的合格范围。柠檬烯占比相对集中，在1.12%～2.08%之间，变异系数为11.40%，其平均值与中位数分别为1.54%和1.51%；参照国际标准0.5%～1.5%发现，94株（56.62%）柠檬烯占比未达标。异松油烯占比分布较为集中，在2.86%～5.01%之间，变异系数仅为9.14%，平均值为3.74%，对比国家标准1.5%～5.0%发现，仅有单株T075的占比（5.01%）未达规定要求，剩余165株全部达标。

2.2 化学类型分析

4-松油醇、1,8-桉叶油素和异松油烯是划分互叶白千层精油类型的3种决定性化学成分[3]。为了明确本试验中互叶白千层的化学类型，构建了166株单株3种决定性化学成分占比的三维分布图（图2），发现157株（94.58%）的精油符合“化学1型”（Chemotype 1 ‘Type'）要求，属于4-松油醇型，即4-松油醇占比在34%～54%之间，1,8-桉叶油素占比在0～8%之间，异松油烯占比在1%～5%之间。剩余9株（5.42%）属于杂合类型，无法划分成6种主要化学类型中的任何一种，其4-松油醇占比低于34%（为29.90%～33.82%），其中单株T075的异松油烯占比超过5%（为5.01%），单株T207的1,8-桉叶油素占比超过8%（为9.19%）。

2.3 相关性分析

表1列出了互叶白千层测定群体9个性状间的Pearson相关系数。生长性状方面，树高、胸径和树冠截面积相互间具有极显著正相关关系，相关系数为0.334～0.611。鲜叶含油量与3个生长性状间均无明显相关性，与精油中1,8-桉叶油素、异松油烯和4-松油烯占比亦无明显相关性，但与柠檬烯有显著负相关关系（R2=-0.178）。精油核心有效成分4-松油醇与树高存在极显著正相关性（R2=0.219），与胸径、树冠截面积和鲜叶含油量均无明显关系，与精油中1,8-桉叶油素、异松油烯和柠檬烯均存在极显著负相关关系，相关系数为-0.807～-0.227。鲜叶4-松油醇含量取决于鲜叶含油量和4-松油醇占比，所以与二者均具有极显著正相关关系，相关系数分别高达0.900和0.531；鲜叶4-松油醇含量与3个生长性状均呈现负相关性，其中与胸径的负相关性达到显著水平（R2=-0.170）；另外，鲜叶4-松油醇含量与精油中1,8-桉叶油素、异松油烯和柠檬烯均存在显著或极显著负相关关系，相关系数为-0.468～-0.190。

表1 互叶白千层测定群体9个性状Pearson相关分析Table 1 Pearson correlations of 9 traits for testing M. alternifolia population

2.4 主成分分析及性状权重测算

为了鉴别互叶白千层最关键的表型性状，构建优良单株的选择指标体系，并测算各性状的权重，本研究对影响单位面积4-松油醇产量的5个性状进行主成分分析[13,16]。从表2可知，前4个主成分分别解释了总变异的40.44%、22.31%、16.65%和12.97%，累计解释了总变异中的92.38%。第1个主成分主要贡献性状为3个生长性状，第2个主成分主要贡献性状为鲜叶含油量和精油中的4-松油醇占比。依据累计贡献率超过85%的标准，选择前4个主成分及相应分量计算各性状选择权重，构建优良单株评选公式，根据公式（2）测算出综合选择指数，其中a为0.219，b为0.286，c为0.107，d为0.310，e为0.070。

表2 互叶白千层测定单株5个主要性状主成分分析Table 2 Principle component analysis of 5 main traits for testing M. alternifolia individuals

2.5 优良单株选择

依据优良单株评选公式，测算166株测试单株的综合选择指数IC，从高到低排序，按照15%入选率评选生物量、鲜叶含油量和4-松油醇占比综合表现优异的单株。表3列出了互叶白千层25株（15%）最优单株的IC值，优良单株IC值分布在110.55～130.63之间，明显大于全体平均指数值100。同时，按照国际标准ISO4730—2017要求，分析了影响精油品质的化学成分占比，发现25株测试单株1,8-桉叶油素占比均小于6%，异松油烯占比均在1.5%～5.0%之间，即此2种化学成分占比均达到了国际安全标准（数据未列出）。但分析柠檬烯占比发现，25株中仅有12株达到国际标准，即占比在0.5%～1.5%之间。这12株符合国际标准的单株依次为：T129、T127、T158、T137、T176、T192、T201、T152、T211、T183、T159 和 T156。

表3 互叶白千层15%最优单株综合选择指数Table 3 Composite selection indices for top 15% M. alternifolia individuals

进一步分析发现，25株优良单株5个性状平均值分别为7.00 m、8.35 cm、3.13 m2、11.80 g/kg、41.81%，其群体现实增益分别为14.50%、15.20%、46.21%、11.66%和3.85%；12株符合国际安全标准单株的性状均值分别为7.15 m、8.42 cm、3.16 m2、11.95 g/kg和42.92%，其群体现实增益分别为16.96%、 16.07%、 47.63%、 13.08%和 6.61%（表4）。

表4 互叶白千层优良单株现实增益分析Table 4 Realistic gain for selected superior individuals of M. alternifolia

3 结论与讨论

1）本研究系统分析了粤北互叶白千层引种资源中211株单株的9个重要经济性状，综合评选出12株生长迅速、鲜叶含油量高、精油中4-松油醇占比大、精油品质达到国际标准ISO4730—2017要求的单株，为发展互叶白千层无性系资源林提供了重要物质保障。我国20世纪90年代引进互叶白千层后，主要栽种在广东惠州和肇庆、广西平南和钦州等南亚热带地区[10-12]。本研究将互叶白千层引种到粤北中亚热带地区，并通过生长性状测定与精油化学成分分析，证实其具有良好的生长适应性，且精油含量与广西等地同类研究的9.1～13.5 g/kg近似[10,12]，这为拓宽我国互叶白千层生产区域提供了重要的基础数据。

2）引种资源目标性状遗传变异程度与选育潜力紧密相关[13,17]。本研究发现，互叶白千层树高和胸径具有中等水平的遗传分化，影响鲜叶产量的树冠截面积分化非常明显，变异系数达44.74%，为选育高生物量的无性系奠定了基础。在精油产量方面，重要性状鲜叶含油量与鲜叶4-松油醇含量均呈现出较高的遗传分化，且4-松油醇占比稳定在较高水平（变异系数仅为8.81%），为选育高产、稳产、优质互叶白千层单株提供了保障。

3）互叶白千层精油化学类型及其品质与经济价值紧密相关[4]。当前茶树油产业发展的关键是选育4-松油醇型优良品系，即选育4-松油醇占比高、1,8-桉叶油素和柠檬烯占比低的品系[7-8]。本研究分析发现，粤北引种群体中94.58%为4-松油醇型，5.42%为杂合类型。杂合类型的产生可能与种子园天然授粉过程中参杂其他类型花粉有关，这要求种植业主须进一步优化种植品系。精油品质分析发现，1.20%的单株异松油烯或1,8-桉叶油素超标，56.62%的单株柠檬烯占比超标，进一步说明粤北发展互叶白千层种植业需优化遗传材料的品质。为了规避有性繁殖过程中的遗传分化，建议选种高产、稳产、优质的互叶白千层组培苗[11,18]，发展无性系原料林。

4）选育互叶白千层优良单株，一个关键是选定影响单位面积4-松油醇产量与品质的重要经济性状，另一个关键是科学确定各经济性状的权重[16]。本研究在构建优良单株评选指标体系过程中，综合考虑了单株生物量、鲜叶含油量、精油中4-松油醇占比、精油品质关键成分占比等因素，并采用主成分分析法科学确定各经济性状的权重。影响生物量的3个生长性状、鲜叶含油量和4-松油醇占比被选为正向选择经济性状，纳入综合选择指数计算公式；影响精油品质的1,8-桉叶油素、异松油烯和柠檬烯占比不直接决定4-松油醇产量，不宜作为正向选择性状，故未纳入综合选择指数计算公式，但被选为评选体系的逆向淘汰性状。经济性状权重分析发现，4-松油醇占比权重偏低，仅0.070，这可能与全体测试单株精油中4-松油醇占比较高且变异幅度不大有关，亦再次说明测试单株的4-松油醇占比稳定在较高水平。

5）鉴于粤北引种资源的遗传背景不清楚，其杂交亲本、组合配置、杂交数量不清晰，因而不能确定各单株表型性状产生分化的遗传机制。因此，有必要采用细胞学、生理生化以及分子生物学等方法，深入探索粤北互叶白千层的遗传背景、遗传变异规律及其产生的调控机理，同时系统开展基因型与环境互作研究，为各发展区域选育适宜的优良品系。