密花石豆兰中石豆菲醌的色谱分析

李明娟，吕立华，杨 林

(邵阳学院，湖南 邵阳 422000)

醌类化合物是指分子内具有不饱和环二酮结构，现发现具有较广泛的生物活性，如杀菌、消炎、泻下、抗病毒、抑制肿瘤生长、扩张冠状动脉、提高机体免疫机能等[1-2]，临床上可治疗冠心病、心梗等[3]。天然的醌类生物活性物质，亦是一大类抗肿瘤药物，主要分布在 50 多科 100 多种高等植物的根、茎、枝、叶、果实及心材中[4]。研究天然植物中的醌类化合物，对进一步提高天然植物与药物的利用价值具有直接指导意义。

天然菲醌(phenanthraquinone)衍生物包括邻醌及对醌两种类型，含菲醌类的植物分布在唇形科、兰科、豆科、番荔枝科、使君子科、蓼科、杉科等高等植物中[5]。密花石豆兰(Bulbophyllum odoratissimum Lindl),为兰科植物云南石仙桃(Pholidota yunnanensis Rolfe)的干燥根状茎和假鳞茎[6]，别名果上叶、羊奶果、极香石豆兰、石串莲，是土家族、苗族的民间常用药物，对慢性咽炎，慢性气管炎，肺结核咳嗽、咯血，疮疡肿痛等症等其他慢性炎症有较好的治疗作用[7]。目前已从由植物密花石豆兰中分出一个新型的邻菲醌化合物石豆菲醌[8]。这类菲醌成分生理活性多样、显著，有抗肿瘤活性，近年来成为各国学者研究的焦点。因此，对密花石豆兰石豆菲醌的分析，对研究密花石豆兰的药用部位和价值具有指导意义，为进一步开发该药物打下基础。本实验采用有机溶剂超声提取的方法提取菲醌，建立硅胶薄层色谱的鉴别方法和高效液相色谱法定量分析方法，对其含量测定进行了分析，据此亦可作为密花石豆兰质量控制的参考。

1 仪器和试药

Waters2695高效液相色谱仪，含四元梯度泵、自动进样器；万分之一电子分析天平(Sartorius 公司)；UV-2450紫外-可见分光光度计(日本岛津公司)；锐思捷超纯水机Unique系列(南京伊若达仪器设备有限公司)；超声波清洗器KQ3200B型(昆山市超声仪器公司)；薄层层析所用硅胶(颗粒范围 10～40 μm)(青岛海洋化工厂)，石豆菲醌对照品(曼斯特生物科技有限公司，批号：MUST-14032101)；甲醇为色谱纯由天津科密欧化学试剂公司提供，其它试剂均为分析纯；液相用水为超纯水。

2 溶液的制备

2.1 对照品准溶液的配制

精密称取五氧化二磷干燥至恒重的石豆菲醌对照品25 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇使溶解，加水至刻度，摇匀，制得对照品贮备液，精密量取贮备液1 mL置10 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

2.2 供试品溶液的配制

密花石豆兰干燥药材粉碎，过 60 目筛，精密称定粉末25.0 g，加入250 mL甲醇，摇匀，精密称定，用超声波清洗器于40 ℃水浴中超声提取 30 min，冷却至室温，加甲醇补足至原称定重量，以6 000 r ·min-1离心10 min，取上清液，用0.45 μm微孔滤膜过滤，滤液即得供试品溶液[9]。

3 色谱方法建立与结果

3.1 色谱鉴别

以甲醇为溶剂，将供试品溶液稀释配制为1 mg/mL的溶液，取供试品与标准品的甲醇溶液，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-丁酮(9.4∶0.3∶0.3)为展开剂，展开，取出，晾干，置碘缸中检视，两者在相应位置出现相同颜色斑点[10]，可确认该供试品为石豆菲醌。

3.2 色谱定量分析

3.2.1 检测波长的选择

为确定石豆菲醌标准品的最佳吸收波长，应用紫外-可见分光光度计在190～400 nm波长范围内对石豆菲醌标准溶液进行扫描[11]，发现其在266 nm 波长处具有最大吸收，因此，高效液相色谱检测波长选定为266 nm。

3.2.2 色谱条件

色谱柱：以Agilent Eclipse XDB-C 18 (4.6 mm ×250 mm，5 μm)为色谱柱，流动相为乙腈-水(60∶40)，流速为1.0 mL/min，检测波长为266 nm；柱温：室温30℃，进样量:10 μL。在此色谱条件下获得对照品溶液、样品溶液的色谱图如图1、2所示。

图1 石豆菲醌对照品溶液高效液相色谱图

图2 密花石豆兰供试品溶液高效液相色谱图

3.2.3 线性与范围

按照2.1项下制得的对照品贮备液，精密量取1.0、2.0、4.0、8、10.0 mL置10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀。依照上述高效液相色谱法条件记录峰面积，各进样10μL。以石豆菲醌对照品浓度(μg·mL-1)为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，进行线性回归，得回归方程Y=687958X-1215，r=0.9892，实验表明，石豆菲醌在测定浓度为50～500μg·mL-1的范围内与其峰面积具有良好的线性关系。

3.2.4 精密度试验

精取石豆菲醌对照品溶液，重复3天进样，每日重复进样5次，记录峰面积，以测定其日内精密度和日间精密度。计算待测峰峰面积的相对标准偏差RSD，结果，日内精密度为0.98%和日间精密度RSD为2.12 %，说明仪器的精密度良好。

3.2.5 稳定性试验

精取同一供试品品溶液，在配制后室温放置0、2、4、6、12、24 h分别进样1次，计算峰面积相对标准偏差RSD为1.13%，说明样品溶液的稳定性良好。

3.2.6 重复性实验

取同批样品，按“2.2”项下制备供试品溶液 6 份，分别按上述的色谱条件重复进样,每份平行测定两次，并计算各份的石豆菲醌含量，其RSD为1.39%，重现性良好。说明方法的重复性良好。

3.2.7 回收率试验

取同一批号的密花石豆兰样品，含量为0.0986%，按上述2.2方法制备供试品溶液按上述色谱条件分离、测定，计算回收率，结果见表1。表明方法的回收率良好，准确度较高，方法可行。

表1 加样回收率试验

3.2.8 样品的含量测定及结果

取不同批次的5批密花石豆兰，每批精密称取2.5g各3份，按上述2.2方法制备供试品溶液并测定石豆菲醌含量。结果见表2所示。

表2 5批样品含量测定的结果

4 讨论

石豆菲醌系菲醌类化合物，是新药开发研究中一个非常重要的资源。天然菲醌分为邻菲醌及对菲醌两种类型，具有菲醌母核，属于二萜类化合物，建立天然菲醌化合物的分析方法，能对天然药物的开发和质量控制研究奠定基础。目前，对密花石豆兰菲醌类化合物的分离分析几乎未见文献报道，本课题经过多次预试试验，采用有机溶剂超声提取的方法能较大程度地提取菲醌化合物，通过硅胶薄层色谱建立初步的鉴别方法，并探索了高效液相色谱法定量分析的条件与方法，经过一系列的方法学考察，证明该方法操作方便，分离效果好、精密度和重现性高，稳定性好；测量结果准确、可靠，能为密花石豆兰石豆菲醌的质量研究提供参考依据，也为密花石豆兰等其他兰科植物的资源的开发利用提供了分析方法。