人肝细胞培养液中卡维地洛对映体柱前衍生化RP-HPLC法测定

蒋 卉，胡志强

(1.泰州医药高新技术产业园区公共平台服务中心，江苏 泰州 225300；2.泰州学院，江苏 泰州 225300)

卡维地洛(carvedilol)临床上用于原发性高血压的治疗，可单独使用或与其它抗高血压药特别是噻嗪类利尿剂联合使用，还可治疗有症状的充血性心力衰竭，其通过α1-受体阻断作用和非选择性的β-受体阻断作用而引起两种毛细血管的扩张，减少外周阻力从而降低血压。卡维地洛分子结构中含一个手性碳原子，所以有一对对映体，临床上通常以外消旋体给药，但研究表明，(R)-(+) Carvedilol和(S)(-) Carvedilol对于α1-受体的拮抗效果相同，但是对于β-受体的阻断作用，S构型比R构型强100倍，因此，卡维地洛对映体的拆分对其药动学研究具有重要作用。

手性拆分是手性药物开发的一个热点，是进行含量测定和药物代谢动力学研究的基础[1-2]。已报道的拆分卡维地洛对映体的方法有手性固定相[3]和手性衍生物法等。但手性固定相制备成本高，手性柱使用寿命短，通用性差，柱前衍生化是对手性药物分离的间接方法，具有成本低、重复性好等优点。因此本研究采用柱前衍生化拆分卡维地洛对映体，为该药的质量控制和药动学提供方法支撑。

1 试药与仪器

1.1 仪器

高效液相色谱仪(HP1050，美国惠普公司)；荧光检测器(1046A，美国惠普公司)；pH仪(梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司)；电子天平(梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司，精度0.1 mg)。

1.2 试药

(R)-(+) Carvedilol、(S)-(-) Carvedilol标准品(Dikma 公司)；卡维地洛外消旋体标准品(上海百世凯化学科技有限公司)；2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-葡萄糖异硫氰酸(GITC，sigma公司)；乙腈、甲醇(色谱纯，国药集团化学试剂有限公司)；DMSO(细胞培养专用，sigma公司)；磷酸、磷酸氢二钠(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)。

2 方法与结果

2.1 溶液的配置

(R)-(+) Carvedilol、(S)-(-) Carvedilol和GITC 分别用乙腈配置成母液，贮存于冰箱；称取卡维地洛外消旋体对照品10 mg，用DMSO溶解、超声、并定容至100 mL容量瓶，得到储备溶液。

2.2 色谱条件

色谱柱：Hypersil BDS C18柱(4. 6 mm×150 mm, 5 μm)，流动相：乙腈-0.02 mol/L磷酸氢二钠(25∶75)，以分析纯磷酸调pH值至4.3，柱温：35℃，流速：1.0 mL/min，荧光检测激发波长：285 nm，发射波长：340 nm，进样量：5 μL。

2.3 样品制备

正常人肝上皮细胞L02(广东省人民医院医学研究中心惠赠)，用DMEM/F12培养液培养在6孔培养板(1.0×106～1.5×106细胞/孔)中，加入卡维地洛外消旋体溶液，在37℃、5%CO2，培养箱中培养24 h。

2.4 样品处理

取样品上清液400 μL，加入2 mL二氯甲烷，旋涡10 s，离心5 min，取上清液100 μL加入100 μL GITC(50 μg/mL)溶液，盖紧瓶塞，涡旋混合l min，室温放置反应2 h后，取5 μL进样。

2.5 方法特异性考察

分别取不同的细胞培养液加入卡维地洛消旋体样品，按“样品处理”项下处理，进样，考察其特异性。卡维地洛与细胞液中其他内源性杂质峰分离良好，(R)-(+) Carvedilol保留时间3.63 min，(S)-(-) Carvedilol 4.77 min。色谱图见图1。

Chromatographic conditions: Hypersil BDS C18column with acetonitrile sodium/dihydrogen phosphate buffer solution(25/75, v/v) as mobile phase，pH 4.3

图1 色谱图

Fig.1 Chromatogram of the separation of

the enantiomers of carvedilol

2.6 标准曲线的制备

取空白细胞培养液200 μL，加入(R)-(+) Carvedilol、(S)-(-) Carvedilol 标准品溶液200 μL，使卡维地洛终浓度为1.0，2.0，4.0，10.0，20.0，40.0 mg/L，按“样品处理”项下衍生化后操作，以浓度C(mg/L) 为横坐标，卡维地洛衍生物峰面积A为纵坐标进行线性回归，R异构体得回归方程为A=4600.3+5748.6C(r = 0.9999)，S异构体得回归方程A=4642.9+6211.3C(r = 0.9996)。

2.7 检测限实验

取卡维地洛消旋体溶液，逐步稀释后，按“样品处理”项下衍生化后操作，测得最低检测限为0.066 mg/L。

2.8 精密度与回收率考察

200 μL空白细胞培养液中加入浓度为10.0，20.0，30.0 mg/L的卡维地洛异构体标准溶液200 μL，得分别为5.0，10.0，15.0 mg/L 的高、中、低3种浓度样品，按“样品处理”项下衍生化后操作，计算日内及日间RSD，考察方法的精密度及回收率。结果见表1 。

表1 精密度和回收率实验结果(n=5)

3 讨论

3.1 衍生化条件的选择

手性药物柱前衍生化拆分的实验过程中，溶剂的影响是明显的，因为许多溶剂可阻止衍生反应的发生或使反应不完全，导致回收率较低。因此，本实验中选用惰性较好的乙腈作为最佳的提取溶剂，其分子中没有和衍生剂反应的活性基团。

GITC的浓度、反应时间对衍生化的影响。GITC是一种非常活泼的异硫氰酸酯类衍生化试剂，在室温下即可与反应化合物侧链上的氨基进行化学反应，得到稳定的非对映异构的硫脲衍生物。实验考察了不同浓度的GITC对衍生化反应的影响。GITC浓度过低时，衍生化反应不完全，随着衍生化试剂的增加，卡维地洛衍生物峰面积逐渐增大。但当GITC的摩尔量大于Carvedilol的4倍以上时，继续增大GITC浓度，衍生化产物的峰面积不再增加。同样，反应温度也影响着衍生化反应，在其他条件相同的情况下，实验考查了室温、40℃、50℃和60℃水浴条件下反应衍生物的生成量，结果表明，随着反应温度的升高，衍生化产物峰面积反而下降，室温时最佳。在上述最佳条件下，考查最佳反应时间，结果显示，结果显示，在反应开始后的1 h内，衍生物增长迅速；2 h时，衍生化产物峰面积达到最大，继续延长反应时间，衍生化产物的峰面积不再增加，故选定反应时间为2 h。

GITC结构对衍生化反应的影响。GITC结构中反应基团异硫氰基与空间位阻较大的全乙酰化β-D-葡萄糖基直接相连，与底物的空间位阻作用对衍生化反应有显著影响。卡维地洛结构中氨基与苯环之间隔2个碳原子，与GITC的空间位阻作用小，可以顺利发生衍生化反应，得到非对映异构体衍生物。GITC结构中的全乙酰化β-D-葡萄糖基具有刚性及亲脂性强的特点，在选定的色谱条件下，GITC的大分子结构在色谱分离中起主要作用。

3.2 卡维地洛外消旋体经人肝细胞代谢后的代谢选择差异

当将卡维地洛外消旋体加入人肝细胞培养液中培养24 h以后，我们测定两种对映体的含量，实验结果显示，经培养后，R异构体的含量要高于S异构体，说明体外代谢，S异构体的代谢量比R异构体大，卡维地洛的代谢存在立体选择性。同时也反映了本实验所建立的方法是可行的，且成本低、分离效果好，可满足卡维地洛对映体的拆分及检测。