实时荧光PCR检测巴西孢子丝菌的实验方法的建立

张明瑞 周盈 李福秋 姚春丽 杨鑫 龚杰 赵飞

(1.吉林大学第二医院皮肤科，长春 130022；2.长春市中心医院，长春 130051；3.中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，北京 102206)

孢子丝菌病(sporotrichosis)是由孢子丝菌复合体(Sporothrixcomplex)感染皮肤、皮下组织、黏膜和局部淋巴系统所引起的慢性感染性疾病[1]。病程较长，皮损可固定于局部，或沿淋巴管走行，严重者可通过血行系统播散，引起内脏器官的感染，也有报道称吸入的孢子可直接引起肺部感染[2]。随着分子检测手段的不断发展，通过对基因序列的种系研究表明，申克孢子丝菌是由多个亲缘种构成的复合体[3]，其中球形孢子丝菌(Sporothrixglobosa)、申克孢子丝菌(Sporothrixschenckiisensustricto)、巴西孢子丝菌(Sporothrixbrasiliensis)以及卢里艾孢子丝菌(Sporothrixluriei) 是临床感染中最常见的致病菌，其余孢子丝菌多为环境菌株，例如墨西哥孢子丝菌(Sporothrixmexicana)[4]。研究表明，不同种之间在致病力及药物敏感性方面存在明显差异[5-8]。因此，在孢子丝菌病的诊断及治疗过程中，对病原菌鉴定到种是十分必要的。本研究拟建立一种快速、灵敏和特异的巴西孢子丝菌实时荧光PCR检测方法，精准鉴定巴西孢子丝菌，为实验室检测、流行病学调查以及临床快速诊断提供有力的技术支持。

1 材料与方法

1.1 菌株与DNA提取

实验菌株：巴西孢子丝菌、球形孢子丝菌、申克孢子丝菌各1株，常见致病真菌其他种属28株(见表1)。其中，申克孢子丝菌标准株CBS498.86T，巴西孢子丝菌标准株CBS 120339T，由中国医学科学院皮肤病研究所医学真菌保藏中心惠赠，其余菌种来源于北京大学真菌和真菌病研究中心菌种保藏中心；3株表皮常见细菌的核酸，由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所诊断室惠赠。

上述所有菌种均经过形态及分子鉴定至种水平。健康志愿者皮肤组织1份，BALB/c小鼠组织1份。上述菌种及组织标本使用QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN 51306) 试剂盒按操作手册提取核酸，提取的核酸-20℃冰箱保存。

1.2 主要试剂、仪器及实验动物

2×Taqman PCR MasterMix (Solarbio)；Nuclease-free water (Promega)；Potato Dextrose Agar 培养基(BD 211550)；QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN 51306)。Real-time PCR仪C1000 Thermal Cycler (BIO RAD); Nanodrop2000C (Thermo)。BALB/c小鼠，雌性，6～10周龄，体重25～30 g。

表1 文中涉及的DNA及菌株列表

1.3 引物与探针

对NCBI数据库中孢子丝菌所有种属ITS基因序列进行比对，选取巴西孢子丝菌特异性序列，使用Primer Express Version软件设计引物及TaqMan探针，并进行手动调整，荧光标记为Cy5，引物及探针序列见表2。引物及探针序列由上海生物工程股份有限公司合成。

表2 引物及探针序列

1.4 实时荧光PCR扩增条件优化

体系退火温度从55℃～62℃进行梯度优化，确定扩增的最优退火温度。优化检测体系：2×Taqman PCR MasterMix 12.5 μL，上游引物Sb-ITS-F(25 μmol/L) 0.2 μL，下游引物Sb-ITS-R(25 μmol/L) 0.2 μL，探针Sb-ITS-MGB-P(25 μmol/L) 0.1 μL，DNA模板 5.0 μL，Nuclease-free water 补至25.0 μL。体系使用BIO-RAD C1000 Thermal Cycler real-time PCR仪进行扩增。扩增条件：95℃预变性10 min，1个循环；95℃变性15s，58℃退火30s，45个循环。

1.5 实时荧光PCR体系特异性、灵敏度以及检测限的测定

使用35种其他常见病原菌、人及小鼠基因组(见表1)进行体系特异度验证。将巴西孢子丝菌标准株(CBS 120339T)核酸进行10倍浓度梯度稀释(浓度从2ng/μL～0.2fg/μL，共计8个梯度浓度)，进行灵敏度及检测下限的测定。

1.6 感染动物模型建立、组织培养及核酸提取

将巴西孢子丝菌标准株(CBS 120339T)转种至PDA培养基活化培养，30℃，培养14 d。生理盐水冲洗培养基表面，收集菌液，无菌纱布过滤，除去菌丝及培养基成份，3500 r/min，离心收集孢子。弃上清，沉淀用少量无菌生理盐水重悬，孢子悬液在显微镜下用血球计数板计数，调整菌液孢子浓度至107cells/mL。使用一次性无菌注射器吸取0.2 mL孢子悬液，腹腔注射感染BALB/c小鼠。感染14 d后脱颈处死，取脏器(脑、肝、肺、脾、肾、淋巴结)匀浆，取100 μL进行核酸提取及荧光PCR检测，再取稀释100倍后匀浆液100 μL接种在含有氯霉素的PDA培养基。

1.7 结果判读

荧光PCR检测每次须设立无模板对照(NTC)、阴性对照(NEG)和阳性对照(POS)，只有NTC(-)、NEG(-)、POS(+)，判定为有效扩增。检测为有效扩增时，Ct值<40为阳性结果；Ct值>40为阴性结果。接种感染动物的6种组织匀浆的培养基置于30℃培养箱，培养7 d后观察，并设置阳性培养和空白对照。7 d后，有孢子丝菌菌落生长，为培养阳性结果；30 d后，仍无菌落生长则为培养阴性结果。

1.8 伦理声明

本实验中使用的人类基因组DNA及实验动物均经过吉林大学第二医院伦理委员会批准(批号：2018-018)。实验动物的使用符合实验动物福利和伦理的要求，符合国家科技部《关于善待实验动物的指导性意见》等法规的规定。

2 结 果

2.1 实时荧光PCR体系优化

通过对NCBI数据库孢子丝菌属ITS序列对比，共设计出3套引物及探针组合。3套体系对于非孢子丝菌属其他核酸均展示出良好特异性，但其中两套体系对于申克孢子丝菌重复验证时，有时会出现非特异性扩增。最终，1套不会引起属内的非特异性扩增的TaqMan MGB体系定为最终检测体系(见表2)。在55～62℃范围内的退火温度下，标准浓度核酸检测Ct值相差0.64，经重复试验，选用Ct值最小的58℃作为最适退火温度。

2.2 实时荧光PCR方法的特异性及检测限的评价

本方法对33种常见病原菌、人类基因组以及小鼠基因组检测结果均为阴性，特异性可达100%。 使用浓度从2 ng/mL～0.2 fg/mL的巴西孢子丝菌核酸扩增获得标准曲线及对数曲线见图1。按照优化的反应体系和反应条件进行荧光PCR，每个浓度梯度做3个平行样。结果显示，本实验中实时荧光PCR体系检测限为100 fg。

2.3 感染动物模型组织培养及荧光PCR检测结果

感染小鼠脏器匀浆培养，除脑组织外，培养结果全部阳性。对生长的真菌进行形态学及分子鉴定，均为巴西孢子丝菌，证明感染模型建立成功，并且孢子由腹腔播散，引起多脏器感染(见图2)。6种组织匀浆核酸荧光PCR检测结果，除脑组织阴性外，其余5种组织巴西孢子丝菌核酸检测结果均为阳性，Ct值30.55～38.78(见图3)。

3 讨 论

巴西孢子丝菌是孢子丝菌复合体中重要的临床致病菌，主要分布在巴西。其宿主除了人类之外，也可引起以猫等动物的感染。猫的口腔环境温度为37.7～39.1℃，pH值为7.5～8.0，十分有利于巴西孢子丝菌酵母细胞生长繁殖。通过感染动物的抓咬，巴西孢子丝菌不仅能够引起人类的感染，也可在动物之间传播，成为其主要的传播途径[9]。作为重要的人畜共患病，由巴西孢子丝菌引起的孢子丝菌病，常具有较重的临床表现，并且能够引起内脏及邻近骨的感染，甚至侵犯中枢神经系统，导致宿主死亡[10-12]。近些年，孢子丝菌病报道不断增多，尤其是临床表现严重的病例。在巴西，仅有记载的巴西孢子丝菌感染病例就超过4000例，并且由于孢子丝菌病不是必须上报的病种，其真实感染情况要远高于记载数据[9]。

目前孢子丝菌诊断方法中，组织标本培养仍然是金标准[13]。但由于培养耗时较长，通常需要2～4周，不适用于临床的快速诊断以及流行病学调查，因此基于核酸检测的分子诊断逐渐成为研究热点。目前应用于孢子丝菌检测及鉴定的分子手段主要包括“生物条形码”的扩增测序[3,14-18]、巢式PCR[19-20]、限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP )[21]、滚环扩增(rolling circle amplification, RCA)[22]以及特异性引物PCR[23]等。上述检测方法中，除巢式PCR外，其余方法均能够直接鉴定到孢子丝菌种水平。但是基于普通PCR的测序或者再酶切等方法，往往耗时较长，并且RFLP以及RCA只能用于纯菌的检测。2015年，由Rodrigues[23]建立的特异性引物PCR，依据不同孢子丝菌特定区域特异性PCR产物片段大小，可检测并区分几种常见的孢子丝菌。其对巴西孢子丝菌的检测下限为100fg，并通过感染小鼠的内脏组织模拟临床标本，评估其检测组织中的病原菌的能力，是目前报道的最灵敏和特异的孢子丝菌PCR检测方法。荧光PCR技术凭借其灵敏度及特异性高，耗时短，重复性好、全封闭反应等重多优势，逐渐成为病原菌鉴定及诊断重要的工具，并且已经广泛且有效地运用在细菌(结核分枝杆菌)、病毒(HIV，HCV)以及一些真菌(曲霉)等病原微生物的诊断[24]。但是在孢子丝菌属的检测中应用较少。

图1实时荧光PCR体系对巴西孢子丝菌标准浓度梯度核酸的扩增曲线(左)及模板浓度对数曲线(右)图2巴西孢子丝菌感染小鼠内脏组织培养结果(将内脏组织匀浆稀释100倍后，取100μL涂PDA平板，从左至右依次为脑、肝、肺、脾、肾、淋巴结)

Fig.1The amplification curves of the series gradient concentration templates (left) and standard curve of the real-time PCR assays(right).(1：10ng，2：1ng，3：100pg，4：10pg，5：1pg，6：100fg，7：10fg，8：1fg，9：NTC)Fig.2The culture results of tissues infected byS.brasiliensis.(left to right: brain, liver, lung, spleen, kidney and lymph nodes)

图3实时荧光PCR检测巴西孢子丝菌感染小鼠内脏组织匀浆Ct值(Ct值从小到大以此为脾30.55，肝30.82，淋巴结34.04，肾34.46，肺38.78，脑组织为阴性结果)

Fig.3The Ct values of tissues infected byS.brasiliensisdetected by real-time PCR.(spleen 30.55, liver 30.82, lymph node 34.04, kidney 34.46, lung 38.78, brain tissue was negative.)

内转录间隔区(ITS)通常包括ITS1、5.8S和ITS2，长度一般在500～750 bp。ITS区在进化过程中承受的自然选择压力比较小，能容忍更多的变异。其在绝大多数的真核生物中表现出广泛的多态性，在亲缘关系接近的物种中也能够表现出差异，即具有种内相对一致，种间差异明显的特征。因而广泛应用于真菌属内不同种间或近似属间的系统发育研究中。ITS序列具有高拷贝数的特点，在每个单倍染色体基因组中拷贝数超过200个，提高检测的灵敏度。孢子丝菌属中，巴西孢子丝菌的基因序列较保守，种间相似度很高，而申克孢子丝菌种内序列具有很多差异位点[25]。这些差异片段，很容易导致属内的非特异性扩增，增加了特异性引物及探针的设计难度。同时，实时荧光PCR要求其目的片段长度为100～150 bp，在较短的基因片段上，既要设计出能够扩增巴西孢子丝菌引物，同时也要设计出符合荧光PCR要求的探针，也是本研究的一个难点。通过软件比对以及手动调整序列，我们共获得3套候选的引物及探针组合。经验证后，得到1套含有TaqMan MGB探针的体系(见表2)，这套体系灵敏度及特异性良好，检测下限为100 fg。虽然与特异性引物检测方法的检测下限相同，但是本研究方法无论从操作步骤、检测时间、结果读取以及污染风险方面，均具有明显的优势。为进一步验证本研究方法对组织中巴西孢子丝菌感染的检测情况，实验构建了小鼠感染模型，并与组织培养进行对比。结果显示，荧光PCR结果与金标准-培养方法对不同组织的检测结果一致。目前国内尚未发现巴西孢子丝菌，因此本实验方法只能通过标准株构建，并通过感染动物模型进行验证。缺乏临床菌株的验证，是本研究的不足之处。

综上所述，本实验成功建立巴西孢子丝菌的实时荧光检测方法，并进行了感染动物模型验证。该方法可以为流行病学研究及监测，甚至临床诊断提供技术支持。