磁共振T1rho技术定量诊断大鼠肝纤维化

黎继昕，赖炳佳，张 帆，梁碧玲，杨绮华

(中山大学孙逸仙纪念医院放射科，广东 广州 510120)

肝纤维化是肝硬化的前期阶段，其主要病理改变为多种大分子物质沉积，形成新的纤维组织。目前病理活检是诊断肝纤维化的金标准，但其为有创检查，难以用于常规追踪复查。自旋-晶格弛豫时间，也称T1ρ或T1rho，对低频运动及稳态过程均较为敏感，可用于检测大分子成分及组织内质子物质交换，故可用于诊断肝纤维化。本研究采用T1rho技术检测大鼠肝纤维化，旨在于动物模型层面观察T1rho对肝纤维化的定量诊断价值。

1 材料与方法

1.1 建立肝纤维化动物模型 选取SPF级雄性SD大鼠60只(广东省动物实验中心提供)，体质量180～220 g，平均(206.20±12.21)g，随机分为实验组45只，对照组12只，3只备用。

实验组：大鼠检疫期过后，将CCl4与橄榄油以2∶3配成40%CCl4油溶液，注入大鼠腹腔，剂量0.2 ml/100 g体质量，每周2次，每次间隔3天以上，连续注射10周，建立肝纤维化模型。对照组：对大鼠腹腔注射0.9%氯化钠，注射剂量为0.2 ml/100 g体质量，注射方法及注射时间同实验组。

1.2 仪器与方法 采用Philips Achieva TX 3.0T双源临床用MR仪，5.0 cm动物线圈。扫描序列为常规轴位及冠状位T2W、轴位T1W、轴位3D BLOCK T1rho，具体扫描参数见表1。实验开始后第1、2、4、6、8、10周分别取实验组5～6只大鼠以及对照组2只大鼠于给药48 h后进行MR扫描，以避免给药后急性损伤的影响。

1.3 图像分析 由2名具有5年以上MR阅片经验的医师分析并测量数据，并以平均值作为最终测量值。采用Philips IDL软件，生成T1rho map，然后以Image J(NIH, Bethesda, MD)软件进行量化分析。参考Wang等[1]方法测量T1rho值，于T1rho map上手动画取5个椭圆形ROI，5层图像共25个ROI，取其均值。

1.4 病理检查 结束MR扫描后，取大鼠肝脏进行Western Blot检查，检测α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)表达水平，并行病理学检查，常规HE染色及天狼星红染色。采用啮齿类动物的肝纤维化分级标准[2]，将大鼠肝纤维化等级分为F0～F6级。

1.5 统计学分析 采用SPSS 22.0统计分析软件。计量资料以±s表示。采用单因素方差分析比较不同级别肝纤维化大鼠T1rho测量值，组间两两比较采用LSD法。对肝纤维化分级与α-SMA表达水平、T1rho测量值的相关性采用Spearman相关分析；α-SMA表达水平与T1rho测量值的相关性采用Pearson相关分析。对2名医师的T1rho测量值采用组内相关系数(intraclass correlation coefficient， ICC)进行一致性分析，ICC>0.8为一致性好。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同肝纤维化大鼠T1rho测量值的比较 实验组造模过程中共13只大鼠死亡，余32只大鼠成模情况为F0级2只、F1～F6级各5只；对照组12只均为F0级。2名医师T1rho测量值的ICC为0.99，一致性好。将对照组与实验组F0级大鼠合并为F0组，F0～F6级肝纤维化大鼠的T1rho值分别为(40.68±1.60)ms、(42.80±1.08)ms、(44.98±1.04)ms、(46.47±3.47)ms、(47.73±3.84)ms、(55.38±7.46)ms、(57.08±5.11)ms(图1)，总体差异有统计学意义(F=30.72,P<0.01)；除F0与F1级、F1与F2级、F2与F3～F4级、F3与F4级、F5与F6级差异均无统计学意义外，余两两比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。

2.2 大鼠肝脏T1rho测量值与肝纤维化分级的相关性 大鼠肝脏T1rho测量值与肝纤维化分级呈正相关(r=0.88,P<0.01)，见图2。

2.3 α-SMA表达水平与肝纤维化、T1rho测量值的相关性 α-SMA表达水平与肝纤维化分级呈正相关(r=0.74,P<0.01),与T1rho值呈正相关(r=0.57,P<0.01)，见图3～5。

3 讨论

3.1 T1rho值用于鉴别不同肝纤维化级别的意义及相关性分析 T1rho序列一直被用于探测大分子物质水平，其诊断病变主要依赖于对大分子物质水平变化的敏感度，因T1rho为量化指标，故较单纯形态学观察更为客观、可信。肝纤维化的主要病理改变是胶原、蛋白聚糖类以及其他大分子物质在肝组织细胞外基质内过度沉积，形成新的纤维组织。随着肝纤维化程度加重，细胞外基质内大分子物质相应增多。根据T1rho检测大分子物质水平的成像原理，肝纤维化程度越重，肝脏T1rho值就越高，故理论上可以通过肝脏T1rho值的变化而无创评估肝纤维化程度，并动态观察、评估肝纤维化的变化。

表1 大鼠MR扫描参数

图1 F0～F6级肝纤维化的MR T1rho及病理图 A.T2WI； B.T1rho map图； C.天狼星红染色图(×40)

T1rho技术目前已广泛用于全身多个部位的临床研究[3]，在肝脏的应用研究起步较晚。2003年，Halavaara等[4]率先尝试将0.1T MR T1rho用于人类肝脏成像。2011年，Wang等[1]提出了T1rho技术用于诊断肝纤维化的可行性，并在大鼠胆总管结扎(bile duct ligation, BDL)肝纤维化模型上得到证实。随后，Zhang等[5]进一步证实了T1rho可用于诊断大鼠肝纤维化；Xie等[6]则证实T1rho测量不受脂肪肝的影响，可用于诊断脂肪肝背景下的肝纤维化。

本研究发现，大鼠不同肝纤维化级别的T1rho测量值差异有统计学意义，说明通过T1rho检测大分子物质水平，可以反映出肝纤维化程度的变化，与Wang等[1,7]的研究结果基本一致。但Wang等[1]所用大鼠模型为BDL模型，本研究与之不同；BDL术后15天开始大鼠肝纤维化达到F3水平，术后24天达到F4以上水平，其所形成的纤维间隔较厚，而这可能是其术后38天T1rho测量值高于本研究结果的主要原因。Zhao等[7]所用模型与本研究一致，但研究期限比本研究短，未观察到晚期肝硬化(F5～F6)的T1rho测量值及病理变化。上述2项研究均未对大鼠肝纤维化作出病理分级，仅初步观察了其变化趋势。本研究进一步证实T1rho测量值可将无纤维化的F0级大鼠肝脏与有纤维化的F2～F6级大鼠肝脏区分开来，并能区分轻微肝纤维化的F1级与F3～F6级、早期肝硬化F4级或以下与中晚期肝硬化F5～F6级；虽然T1rho在鉴别轻度F2肝纤维化与中重度肝纤维化到早期肝硬化即F3～F4级时价值较有限，但整体趋势仍是随着肝纤维化级别增高，T1rho测量值呈上升趋势，证明T1rho可诊断用于大鼠模型肝纤维化。

图3 不同肝纤维化分级α-SMA表达水平图

图4 不同肝纤维化分级与α-SMA 水平相关关系的散点图 图5 α-SMA表达水平与肝脏T1rho测量值相关关系的散点图

3.2 α-SMA表达与肝纤维化级别、T1rho值的相关性 α-SMA是肌动蛋白的一个亚型，为平滑肌细胞分化的一个特异性标记。在损伤的肝组织中，肝星形细胞(hepatic stellate cells, HSCs)胶原纤维生成增多(包括Ⅰ类和Ⅲ类胶原)，形成细胞外基质(extracellular matrix, ECM)，会引起HSCs的细胞胞浆中α-SMA的强烈免疫反应，因此，α-SMA表达可用于识别表现为肌动蛋白成纤维细胞表型的HSCs[8]。在体实验[9-10]证实，α-SMA阳性的HSCs与人类慢性肝病的纤维组织累积相关，与肝纤维化级别相关，α-SMA表达水平与肝纤维化相关[11-12]。

本研究中T1rho测量值的变化趋势与α-SMA表达水平的相关趋势也较为一致，随α-SMA升高，T1rho测量值也有增高趋势，从一个侧面反映出HSCs活化、纤维组织形成，细胞外基质大分子物质增多，形成胶原纤维间隔的数量及密度增加，而这正是T1rho测量值增高的原因之一。相对于肝纤维化病理分级而言，α-SMA为量化指标，能从另一侧面比较客观地评估肝纤维化与T1rho测量值的关系。

总之，在大鼠肝纤维化过程中，随着HSCs激活，α-SMA的表达水平上升，ECM大分子物质增加，使得肝脏T1rho测量值上升。α-SMA表达水平与肝纤维化级别、T1rho测量值均呈正相关，大鼠肝纤维化级别与T1rho测量值呈正相关；MR T1rho可用于定量、无创性评估大鼠肝纤维化程度。