黑骨藤追风活络胶囊对类风湿关节炎大鼠PI3K/AKT/HIF-1α通路的作用①

刘 杨 姜珊珊 陈向云 杨 欣 严福林 曹 峰 杨长福 梁 江

(贵阳中医学院，贵阳550025)

类风湿关节炎作为自身免疫病，病理表现为滑膜成纤维细胞病理炎性增生、微血管生成以致骨关节面受累，后期关节畸形难愈。临床治疗药物多针对多种靶点减轻关节和滑膜炎症，抑制滑膜异常病理增殖，如甾体或非甾体抗炎药、免疫抑制剂等。又由于类风湿关节炎患者自身免疫失衡，T细胞、B细胞参与关节滑膜中TNF-α、IL-1、IL-4、IL-17等炎症因子异常表达，可引起骨代谢异常和继发性骨质疏松，可激活PI3K/AKT信号及下游蛋白通路加重病情[1-3]。黑骨藤追风活络胶囊由青风藤、黑骨藤、追风伞构成，辅料为淀粉。属贵州同济堂药业独家开发的专利新药，针对西南地区高原风寒湿气候所诱发的风湿、类风湿关节炎患者有较好的治疗效果。前期研究已表明黑骨藤追风活络胶囊内所含成分黑骨藤有较好的抗炎作用[4-6]。基于上述研究基础，本文采用胶原诱导关节炎(Collagen-induced arthritis,CIA)制作类风湿关节炎大鼠模型，观察黑骨藤追风活络胶囊对类风湿关节炎大鼠模型PI3K/AKT/HIF-1α信号通路的影响，阐明其潜在有效作用机制，为黑骨藤追风活络胶囊的临床应用提供参考。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1药物 黑骨藤追风活络胶囊，批号20170217，由国药集团老来福(贵州)药业有限公司提供。PI3K抑制剂LY294002，货号S1737，由上海碧云天生物技术有限公司提供。黑骨藤追风活络胶囊给药量按正常人体重为60 kg计算，大鼠给药量按照人一天服用量的7倍进行换算后灌胃服用。

1.1.2动物 雄性SD大鼠，180～220 g，由长沙天勤生物技术有限公司提供，动物许可证号为SCXK(湘)-2014-0011，SPF级环境饲养，室温(20±2)℃。动物所用饲料也由上述单位提供。

1.1.3试剂 牛Ⅱ型胶原，批号20021，由Chond-rex公司提供。完全弗氏佐剂，批号F5881，Sigma公司提供。β-actin、Caspase-1、Caspase-3、Cytochrome-C、HIF-1α、Bax、Bcl-2蛋白，货号为ab8226、ab1872、ab13847、ab90529、ab179483、ab32503、ab196495，由Abcam公司提供。p-PI3K、p-AKT蛋白，货号#4228和#13038，由CST公司提供。TUNEL染色试剂盒，货号C1091，由上海碧云天生物技术有限公司提供。山羊抗兔HRG抗体，批号为109525，由北京中杉金桥生物技术有限公司提供。SDS-PAGE凝胶制备试剂盒，货号G1120，由北京索莱宝生物科技有限公司提供。IL-2、IL-4、IL-17 ELISA试剂盒，货号为ERC001、ERC002、ERC170，由欣博盛生物科技有限公司提供。

1.1.4仪器 KD-202A石蜡切片机，由浙江科迪仪器设备有限公司提供。CX21型光学显微镜，由日本Olympus公司提供。开拓牌数显百分测厚仪，由河南华方信息技术有限公司提供。Thermo Fisher Multiskan FC酶标仪，由美国Thermo公司提供。

1.2方法

1.2.1类风湿关节炎大鼠模型制作 准备雄性SD大鼠若干只，随机区分为空白组和造模组，根据参考文献[7]造模组大鼠于第0天和第7天尾根部皮下注射牛 Ⅱ 型胶原与完全弗氏佐剂混匀液诱导大鼠类风湿关节炎。致炎后观测大鼠足趾关节肿胀度，按下列标准计算评分：0分为双侧各足跖趾无红肿；1分为双侧足跖趾轻度肿胀；2分为双侧足跖趾中度肿胀；3分为双侧足跖趾重度肿胀；4分为双侧足跖趾、踝关节全部肿胀或伴有畸形。评分1分以上则随机入组给予药物治疗。选取造模成功的大鼠随机分为模型组、黑骨藤追风活络胶囊(0.315 g/kg)组(胶囊组)、黑骨藤追风活络胶囊(0.315 g/kg)+PI3K抑制剂LY294002(0.01 g/kg)联合给药组(联合给药组)，每组8只。空白组8只，空白组灌胃服用等体积生理盐水，其余各组用羧甲基纤维素钠调配成相应浓度混悬液灌胃，连续给药5周。末次给药后测量每组大鼠足跖部厚度后，腹主动脉取血备用，取部分脾脏放入4%多聚甲醛固定，取剩余脾脏、同侧关节滑膜组织-80℃保存备用。

1.2.2足跖部肿胀度测量 采用厚度测量仪测量大鼠双后肢足跖部炎症诱导前和炎症诱导后每周肿胀度(肿胀度=炎症诱导后厚度-炎症诱导前厚度)，记录并统计分析。

1.2.3脾脏HE染色观察病理变化 低浓度至高浓度乙醇分别脱水，每次1.5 h；二甲苯透明2次，每次30 min；石蜡浸蜡2次，每次3 h。自动包埋机包埋后将包埋好的组织制作成切片。常规二甲苯脱蜡2次，每次20 min；高浓度到低浓度乙醇水化；苏木素染色10 min；自来水冲洗反蓝；盐酸酒精分化5 s后伊红染色5 min；95%乙醇、100%无水乙醇分别脱水10 min；二甲苯透明10 min；中性树胶封片后分析结果并评分。动脉周围淋巴鞘细胞密度评分标准：0分，细胞密度无变化；1分，细胞密度轻微增多；2分，细胞密度中度增多；3分，细胞密度重度增多。初级滤泡增生评分标准：0分，无增生；1分，轻度增生，可见部分生发中心发育；2分，中度增生，生发中心发育明显；3分，过度增生，生发中心增多。

1.2.4TUNEL染色观察脾脏凋亡细胞表达 低浓度至高浓度乙醇分别脱水，每次1.5 h；二甲苯透明2次，每次30 min；石蜡浸蜡2次，每次3 h。自动包埋机包埋后将包埋好的组织制作成切片。常规二甲苯脱蜡2次，每次20 min；高浓度到低浓度乙醇水化；根据试剂盒提供方法滴加不含DNase的蛋白酶K，37℃孵育30 min；PBS冲洗3次，每次5 min；3%过氧化氢封闭30 min；PBS冲洗3次，每次5 min；滴加生物素标记液；DAB显影，95%乙醇、100%乙醇分别脱水10 min；二甲苯透明10 min；中性树胶封片后Image Pro-Plus6.0软件分析平均光密度值表达。

1.2.5Western blot检测关节和脾脏Caspase-1、Caspase-3、Cytochrome-C；滑膜组织p-PI3K、p-AKT、HIF-1α、Bax、Bcl-2蛋白表达 BCA蛋白定量法蛋白定量后，SDS-PAGE凝胶制备12%的分离胶和5%的浓缩胶，上样后80 V电泳2 h，60 V转膜2 h，5%脱脂奶粉封闭2 h后加一抗，内参一抗1∶8 000、其他一抗1∶1 500，TBST冲洗3次，加入二抗1∶7 000，TBST冲洗3次，显影液显影，拍照后Image Pro-Plus6.0软件分析结果。

1.2.6ELISA试剂盒检测血浆IL-2、IL-4、IL-17表达 取大鼠血浆，根据试剂盒要求，稀释标准品，制定标准曲线，按试剂盒操作步骤加入样本测量OD值。

2 结果

2.1黑骨藤追风活络胶囊对类风湿关节炎大鼠足跖部炎性肿胀度的影响 造模后，与空白组比较，模型组大鼠足跖肿胀程度明显增大(P<0.01)。给药后，黑骨藤追风活络胶囊组和联合给药组大鼠足跖肿胀明显减轻，与模型组比较差异具有统计学意义(P<0.01)，与空白组比较差异具有统计学意义(P<0.01)，这表明黑骨藤追风活络胶囊组和联合给药组虽能减轻炎性肿胀，但效果不及空白组，见表1。

2.2黑骨藤追风活络胶囊对类风湿关节炎大鼠脾脏病理的影响 病理观察模型组大鼠脾脏生发中心数量减少或萎缩，动脉周围淋巴鞘数量减少，初级滤泡数量降低。与模型组比较，空白组、黑骨藤追风活络胶囊组、联合给药组动脉周围淋巴鞘数量增加，初级滤泡数量明显增多，与模型组相比，差异具有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。见表2，图1。

Groups1 weekLeftRight2 weeksLeftRight3 weeksLeftRight4 weeksLeftRight5 weeksLeftRightControl0.221±0.1964)0.200±0.1114)0.271±0.1474)0.223±0.1354)0.313±0.1914)0.349±0.1654)0.338±0.2264)0.406±0.1464)0.459±0.2454)0.479±0.1624)Model1.725±0.5372)1.445±0.4422)2.034±0.4242)1.916±0.3812)2.871±0.2952)2.889±0.4162)3.024±0.2922)2.816±0.2752)3.118±0.3362)3.136±0.1952)Capsule1.421±0.6262)1.685±0.5422)1.760±0.2032)1.814±0.3922)2.078±0.5582)4)2.120±0.3762)4)1.944±0.2282)4)2.075±0.2242)4)1.901±0.2452)4)2.021±0.2022)4)Combined treatment1.828±0.3892)2.104±0.5542)1.811±0.3922)2.099±0.2862)1.933±0.2562)4)2.091±0.2392)4)1.995±0.2422)4)1.953±0.3612)4)1.968±0.2072)4)1.992±0.3122)4)

Note：Vs control，1)P<0.05，2)P<0.01;vs model，3)P<0.05，4)P<0.01.

GroupsCell density score of periarteriallymphoid sheathScore ofprimary follicleControl2.375±0.7444)1.250±0.7074)Model0.625±0.5182)0.375±0.5172)Capsule1.500±0.5343)1.750±0.4624)Combined treatment1.375±0.5173)1.500±0.7554)

Note：Vs control，1)P<0.05，2)P<0.01;vs model，3)P<0.05，4)P<0.01.

图1 黑骨藤追风活络胶囊对类风湿关节炎大鼠脾脏病理变化的影响(×200)Fig.1 Effect of Hei Gu Teng Zhui Feng Huo Luo Capsule on pathological change of spleen in RA rats(×200)

2.3黑骨藤追风活络胶囊对类风湿关节炎大鼠脾脏细胞凋亡的影响 与模型组相比，空白组、黑骨藤追风活络胶囊组、联合给药组分别降低类风湿关节炎大鼠脾脏凋亡细胞平均光密度值，差异具有统计学意义(P<0.05)。与空白组比较，模型组大鼠凋亡细胞平均光密度值明显增加，而黑骨藤追风活络胶囊组、联合给药组大鼠脾脏凋亡细胞平均光密度值明显降低。见表3，图2。

2.4黑骨藤追风活络胶囊对类风湿关节炎大鼠脾脏Caspase-1、Caspase-3、Cytochrome-C蛋白表达的影响 与空白组相比，模型组Caspase-1、Caspase-3、Cytochrome-C蛋白表达明显增加，差异具有统计学意义(P<0.01，P<0.05)。与模型组相比，黑骨藤追风活络胶囊可降低类风湿关节炎大鼠脾脏内Caspase-1、Caspase-3、Cytochrome-C蛋白表达。联合给药组可同样降低类风湿关节炎大鼠Caspase-1、Caspase-3、Cytochrome-C蛋白表达，差异具有统计学意义(P<0.01，P<0.05)。见表4，图3。

2.5黑骨藤追风活络胶囊对类风湿关节炎大鼠滑

GroupsAverage optical densityControl0.121±0.1232)Model0.322±0.1861)Capsule0.128±0.1062)Combined treatment0.133±0.0912)

Note：Vs control，1)P<0.05;vs model，2)P<0.05.

膜组织p-PI3K、p-AKT、HIF-1α、Bax、Bcl-2蛋白表达的影响 与空白组相比，模型组p-PI3K、p-AKT、HIF-1α、Bax、Bcl-2蛋白表达显著升高，差异具有统计学意义(P<0.01，P<0.05)。与模型组相比，黑骨藤追风活络胶囊可显著降低类风湿关节炎大鼠滑膜组织p-PI3K、p-AKT、HIF-1α、Bcl-2蛋白表达，提高Bax蛋白表达(P<0.01，P<0.05)。联合给药组也同样降低类风湿关节炎大鼠p-PI3K、p-AKT、HIF-1α、Bcl-2蛋白表达，上调Bax蛋白表达。 见表5，图4。

2.6黑骨藤追风活络胶囊对类风湿关节炎大鼠血浆IL-2、IL-4、IL-17表达影响 与空白组比较，模型组IL-2和IL-17表达升高与空白组有明显差异(P<0.01)。IL-4表达无差异。与模型组比较，黑骨藤追风活络胶囊对血浆中IL-4有上调作用，对IL-2和IL-17表达有下调作用，具有统计学差异(P<0.05)。联合LY294002可同样升高血浆中IL-4表达，降低IL-2和IL-17表达(P<0.05，P<0.01)。见表6。

图2 黑骨藤追风活络胶囊对类风湿关节炎大鼠脾脏细胞凋亡的影响(×200)Fig.2Effect of Hei Gu Teng Zhui Feng Huo Luo Capsule on apoptosis of spleen cells in RA rats(×200)

GroupsCaspase-1Caspase-3Cytochrome-CControl0.052±0.0414)0.037±0.0464)0.085±0.0613)Model0.378±0.1102)0.230±0.0982)0.162±0.0491)Capsule0.055±0.0694)0.053±0.0354)0.066±0.0454)Combined treatment0.060±0.0484)0.093±0.0763)0.039±0.0474)

Note：Vs control，1)P<0.05，2)P<0.01;vs model，3)P<0.05，4)P<0.01.

Groupsp-PI3Kp-AKTHIF-1αBaxBcl-2Control0.004±0.0054)0.085±0.0724)0.004±0.0054)0.002±0.0024)0.021±0.0203)Model0.381±0.2882)0.397±0.1452)0.174±0.1532)0.107±0.0452)0.128±0.0871)Capsule0.033±0.0494)0.102±0.1253)0.009±0.0114)0.381±0.2222)3)0.017±0.0173)Combined treatment0.031±0.0414)0.008±0.0141)4)0.007±0.0114)0.320±0.1352)4)0.034±0.0273)

Note：Vs control，1)P<0.05，2)P<0.01;vs model，3)P<0.05，4)P<0.01.

GroupsIL-2IL-4IL-17Control84.478±41.0184)65.362±38.19872.403±37.2914)Model174.183±57.1912)88.099±33.042167.354±63.3072)Capsule110.539±28.3974)151.614±48.6452)4)73.030±43.9054)Combined treatment92.262±50.0674)166.077±90.4201)3)86.469±51.8913)

Note：Vs control，1)P<0.05，2)P<0.01;vs model，3)P<0.05，4)P<0.01.

图3 黑骨藤追风活络胶囊对类风湿关节炎大鼠脾脏中Caspase-1、Caspase-3、Cytochrome-C蛋白表达的影响Fig.3 Effect of Hei Gu Teng Zhui Feng Huo Luo Capsule on expression of Caspase-1,Caspase-3,Cytoch-rome-C protein in spleen of RA rats

图4 黑骨藤追风活络胶囊对类风湿关节炎大鼠滑膜组织中p-PI3K、p-AKT、HIF-1α、Bax、Bcl-2蛋白表达的影响Fig.4 Effect of Hei Gu Teng Zhui Feng Huo Luo Capsule on expression of PI3K,AKT,HIF-1α,Bax,Bcl-2 protein in Synovial tissue of RA rats

3 讨论

类风湿关节炎是临床发病率较高的自身免疫性疾病，病情复杂，并发症严重，复发率较高，最后导致关节损伤或致畸，终身难愈，多年来受到医学界高度关注。随着科技进步，多种免疫抑制剂、药物提取物在控制类风湿关节炎发作期症状和缓解自身免疫炎症所致骨质侵蚀方面，取得了明显的疗效，但这些药物也存在较多的药物不良反应，引发后续多器官损害。中药复方(包括汤剂、中成药)基于中医辨证论治在改善类风湿关节炎患者临床表现、减少并发症和降低复发率、促进患者其关节功能恢复，延缓自身免疫性炎症带来的后遗症方面取得了良效。黑骨藤追风活络胶囊作为贵州同济堂制药有限公司专利药物，具有祛风除湿、活血通络、消痹止痛的功能，但具体临床作用机制与治疗靶点未有深入挖掘。成药中所含黑骨藤善于通经络，祛风湿，活血消炎，专治跌打损伤，风湿关节痛，口腔炎，乳腺炎等[8]。所含青风藤善于祛风湿、通经络、利小便，专治风湿痹证、关节肿胀、麻痹瘙痒、水肿、脚气等[9]。所含追风伞善于祛风通络、活血止痛。专治风湿痹痛、四肢拘挛、半身不遂、小儿惊风、跌仆、骨折等[10]。黑骨藤追风活络胶囊现阶段已实验证实可通过调节免疫器官功能起到抗风湿性关节炎的作用。同时有报道也指出黑骨藤追风活络胶囊也存在一定的药物毒性，这对完善黑骨藤追风活络胶囊的用药安全认识提供了一定实验依据[11]。还有报道称黑骨藤追风活络胶囊可通过影响miR-146a、miR-16的表达，调控关节液中炎症因子的释放，减轻炎性反应和缓解骨侵蚀，从而减轻风寒湿痹型类风湿关节炎患者关节疼痛，改善风寒湿痹型类风湿关节炎患者生活质量。而类风湿关节炎作为自身免疫病，现阶段共识是炎性反应的过度激活是导致类风湿关节炎滑膜增生和骨质破坏的重要因素[12]。PI3K/AKT/HIF-1α信号通路是类风湿关节炎发生发展中的重要因素，PI3K蛋白家族可被多种细胞因子激活，在细胞分化、代谢、炎症、细胞活力和诱发癌症发挥重要作用。AKT蛋白最初作为一个胰岛素细胞内信号，是细胞生长、增殖等关键蛋白的受体信号，也是PI3K蛋白下游被其激活的蛋白，它的激活可引起多种蛋白的连锁反应，如mTORC蛋白复合体、核糖体S6激酶、凋亡蛋白前体活化、NF-κB蛋白通路、Bcl-2凋亡相关的启动子等[13]。HIF-1α可在组织损伤情况下根据含氧量的变化形成微血管增生和营养供应，它不断地合成和降解，促使机体对缺氧压力做出迅速反应。在缺血缺氧、炎症等疾患中，HIF-1α降解被抑制，并由细胞质转移到细胞核内与HIF-1β形成二聚体，进而激活并引发下游多种生物信号反应并促进新生血管的生成，而血管翳的过度增殖在类风湿关节炎发病中被认为是有害的[14,15]。CD4+T细胞亚群Th1/Th2细胞及Th17/Treg细胞之间的失衡目前也被认为是类风湿关节炎发病直接因素之一，Th1和Th17细胞可产生IL-2、IL-17等造成关节滑膜炎的发生，Th2细胞分泌IL-4可抑制类风湿关节炎TNF-α、IL-1、IL-6的过度释放，发挥抗炎作用。Bcl-2家族是参与细胞凋亡的核心家族，Bax为促凋亡蛋白，Bcl-2为抑制凋亡蛋白，二者动态变化可引起线粒体膜通透性改变，激活线粒体凋亡通路[16，17]Caspase家族是一种促使细胞凋亡的蛋白酶，在细胞凋亡机制网络中被多种凋亡信号调控。Caspase-1可以激活IL-1前体，激活炎症。Caspase-3是细胞凋亡的执行者，也是线粒体凋亡通路和死亡受体通路的交汇点。在损伤、炎症等各种促凋亡信号的激活下，线粒体释放Cytochrome-C，使Caspase家族酶原之间因相互靠近并自我剪切而活化，激活Caspase-3，从而启动Caspase级连反应。通过对胶原诱导构建类风湿关节炎大鼠模型分析后表明，模型组大鼠足跖部肿胀度明显增加，而黑骨藤追风活络胶囊可抑制大鼠关节滑膜组织p-PI3K、p-AKT、HIF-1α、Bcl-2蛋白过表达，上调Bax蛋白表达量，增加滑膜细胞的凋亡，进而减轻足跖肿胀程度(P<0.01)，与PI3K抑制剂LY294002联用给药后表现出良好的协同作用，起到抑制炎症发展的作用(P<0.01)。模型组大鼠免疫器官脾脏内凋亡细胞表达明显增加，Caspase-1，3、Cytochrome-C蛋白表达显著增加，而黑骨藤追风活络胶囊和联合给药组均抑制其过度增殖(P<0.01，P<0.05)，减轻脾脏内细胞凋亡的发生。与空白组比较，模型组大鼠IL-2表达增加，IL-4表达无显著变化，IL-17表达增强。与模型组比较，黑骨藤追风活络胶囊组和联合给药组能明显下调IL-2、IL-17的表达，上调IL-4的表达，对Th1/Th2细胞及Th17/Treg细胞之间有潜在的调节作用。综上，黑骨藤追风活络胶囊可影响PI3K/AKT/HIF-1α信号通路在类风湿关节炎内表达，从而引起一系列调节作用。