软骨脱细胞基质仿生支架体外构建组织工程软骨

贾立涛 姚琳 刘延群 张沛灵 刘豫 曹谊林 周广东

软骨缺损在临床上十分常见，由于成熟软骨没有血管、神经组织和淋巴管，一旦损伤，其自我修复极为困难[1]。利用组织工程技术修复和替代受损软骨组织是解决这一难题的理想手段[2-3]。软骨组织工程包括种子细胞、支架材料和调节信号[4]。其中，支架材料，特别是三维多孔支架，作为种子细胞临时生长的微环境，为细胞输送营养物质和排出代谢废物，在软骨组织再生中具有重要作用[5-6]。

软骨脱细胞基质（Acellular cartilage matrix，ACM）作为天然可降解材料，生物相容性好，免疫原性低，并且软骨基质成分可提供软骨再生微环境，促进软骨细胞外基质分泌和软骨形成，被认为是最理想的软骨组织工程支架材料[7-9]。本研究将软骨组织彻底粉碎后进行脱细胞处理，制成软骨脱细胞基质粉末，复合一定比例的明胶（Gelatin，GT）提升交联性能[10]，经冷冻干燥后制成三维多孔支架；随后复合猪关节软骨细胞，体外成软骨培养8 周，以期能构建具有较成熟软骨组织形态的组织工程软骨。

1 材料与方法

1.1 实验试剂及仪器

高糖DMEM 培养液、0.25%胰蛋白酶、青霉素-链霉素-两性霉素B（Gibco，美国）；胎牛血清、磷酸盐缓冲液（Hyclone，美国）；胶原酶、抑肽酶、核酸酶、Tris-HCL、Triton X-100（Sigma，美国）。

SEM（Philips XL-30，荷兰）；生物力学分析仪（Instron，美国）；真空冷冻干燥机（上海亿倍实业有限公司）；全自动冷冻研磨仪（上海净信实业发展有限公司）。

1.2 实验动物

1 周龄新生小猪1 只（上海甲干生物科技有限公司）。本实验遵守实验动物伦理原则。

1.3 新生小猪关节软骨细胞的获取

无菌条件下切取新生小猪关节软骨组织，切成1～2 mm3小块，置于含0.15%胶原酶的培养基（DMEM）中，37 ℃摇床中消化过夜（100 r/min，8～10 h）。将收获的软骨细胞接种到含有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素-两性霉素B 的DMEM 培养皿（10 cm）中，37 ℃、5%CO2条件下培养。取第2 代软骨细胞备用。

1.4 软骨脱细胞基质粉末的制备

当地屠宰场获取新鲜牛肩胛软骨组织，剔除表面多余组织和筋膜，获得透明软骨片。将样品浸入液氮中5 min，经冷冻研磨成软骨粉末，随后进行脱细胞处理：①0.5%胰蛋白酶/PBS 溶液（w/v）37 ℃恒温震荡24 h，每4 h 更换新的胰蛋白酶溶液；②核酸酶溶液（50 U/mL 脱氧核糖核酸酶、1 U/mL 核糖核酸酶A，溶于10 mM Tris-HCL 中，pH=7.5）37 ℃搅拌4 h；③10 mM Tris-HCL（含10 U/mL 抑肽酶）37 ℃震荡20 h；④1% Triton X-100/PBS 溶液（v/v）37 ℃震荡24 h；⑤PBS 溶液洗涤6 个循环，每次2 h。最后经冷冻干燥制成脱细胞基质粉末，干燥箱储存备用。

1.5 不同ACM/GT 比例三维多孔支架的制备

取适量的ACM 和GT，分别用去离子水配制成浓度为1%的悬浊液，GT 需37 ℃震荡1 h 溶解。取ACM 悬浊液和GT 溶液按不同体积比（ACM:GT 分别为1:9、3:7、5:5、7:3 和9:1）震荡混匀，分别注入特制的模具中，冷冻干燥后与EDC 交联，制成8 mm直径、2 mm 厚的圆柱状多孔支架，大体观察、扫描电镜拍照，环氧乙烷消毒备用。

1.6 不同ACM/GT 比例多孔支架的材料表征分析

1.6.1 孔径大小的分析

通过Image-J 软件分析5 组不同ACM/GT 比例多孔支架的SEM 图片，分别选取不同视野的100 个孔隙测量孔径大小，每组测量3 个平行样品。

1.6.2 孔隙率的分析

分别称量5 组样品干态时的质量M0，将支架浸入无水乙醇2 h 后再次称量支架的质量M1，孔隙率P=（M1-M0）/ρ 乙醇V 支架×100%。其中，ρ 为无水乙醇的密度。每组测量3 个平行样品。

1.6.3 生物力学测试

5 组样品分别置于生物力学分析仪上，沿垂直支架方向以1 mm/min 的速度压缩，直到支架破碎。记录力与位移曲线，计算杨氏模量。每组测量3 个平行样品。

1.6.4 体外降解实验

分别称量5 组样品干态时的质量W0，然后分别放入含有10 mL PBS（pH=7.4）的离心管中，37 ℃摇床、100 r/min 震荡，分别在1、2、4 周时将支架取出，去离子水浸泡冲洗，冷冻干燥后称重并记录干态下质量W1，计算支架在不同时间点时的质量剩余百分数（W1/W0×100%），每组测量3 个平行样品。

1.7 细胞支架复合物的制备

取第2 代软骨细胞，制成1×108cells/mL 的细胞混悬液，均匀接种于已消毒的多孔支架上，37 ℃、5%CO2、饱和湿度下静置4 h，添加培养基后体外培养8 周，每两天换液1 次。

1.8 组织学检测

大体观察体外培养2、4、6、8 周的标本。另取体外培养4 周和8 周的标本，4%多聚甲醛固定48 h，脱水、石蜡包埋，切片（厚度为5 μm），HE 染色及Safranin-O 染色，观察组织结构及细胞外基质分泌情况；免疫组织化学方法检测Ⅱ型胶原的表达情况。

1.9 统计学分析

采用GraphPad Prism 软件（Version 7.0，美国）行统计学分析，数据以（）表示，组间比较采用One-Way ANOVA，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ACM 多孔支架的制备

本研究制备ACM 多孔支架主要分为两个步骤：①制备ACM 粉末；②复合GT 溶液制备三维多孔支架。新鲜软骨组织经低温研磨、脱细胞处理和冷冻干燥制备ACM 粉末（图1A-D）；复合一定比例GT 溶液经冷冻干燥和EDC 交联制备三维多孔支架（图1E-H）。

2.2 不同ACM/GT 比例多孔支架的制备

不同比例多孔支架形状规整，表面粗糙，直径约8 mm，厚度2 mm；大体外观无明显差别；支架表面电镜扫描显示，多孔支架的孔隙分布均匀，孔径大小维持在100～300 μm 之间（图2）。

2.3 不同ACM/GT 比例多孔支架的表征分析

不同ACM/GT 比例多孔支架的孔径大小维持在100～300 μm 之间，随着ACM 含量的增加，支架平均孔径呈逐渐增大趋势（图3A）；5 组多孔支架孔隙率均大于85%，随着ACM含量的增加，支架孔隙率逐渐增大，但同时力学强度逐渐降低（图3B、C）；5 组支架在降解第1、2 周时剩余质量均维持在90%左右，第4 周时，其中4 组支架（1:9，3:7，5:5，7:3）剩余质量在75%左右，而9:1 组剩余质量仅为50%，且部分支架已碎裂（图3D）。

5 组多孔支架中，5:5 组孔径（170 μm、孔隙率86%，适宜体外软骨再生，因此我们选取此组多孔支架用于软骨体外构建。

2.4 体外构建软骨大体观察

细胞支架复合物体外培养2 周时，大体观察显示软骨细胞在支架表面均匀分泌基质，边缘已有新生软骨组织形成，随培养时间的延长，成软骨效果逐渐明显；第8 周时已具有明显的软骨组织特征，且有较好的弹性和韧性（图4）。

2.5 组织学观察

体外培养第4 周时，HE 和Safranin-O 染色显示，已有大量软骨细胞外基质和均匀的特异性软骨陷窝形成，Ⅱ型胶原免疫组化进一步证明了所构建的组织为均匀的软骨组织（图5）。第8 周时，组织学观察显示，软骨陷窝成熟度增加，体外再生软骨质量进一步提高（图6）。

图1 ACM 多孔支架制备Fig.1 Preparation of ACM porous scaffolds

图2 不同ACM/GT 比例多孔支架的大体观及电镜图Fig.2 Preparation of scaffolds with different ACM/GT ratios

图3 不同ACM/GT 比例多孔支架表征分析（*：P＜0.05；**：P＜0.01；***：P＜0.001）Fig.3 Characterization analysis of scaffolds with different ACM/GT ratios (*:P<0.05;**:P<0.01;***:P<0.001)

图4 体外构建软骨大体观察Fig.4 Gross observation of cartilage constructed in vitro

图5 体外培养4 周组织学观察Fig.5 Histological observation after cultured for 4 weeks in vitro

图6 体外培养8 周组织学观察Fig.6 Histological observation after cultured for 8 weeks in vitro

3 讨论

软骨组织工程可再生具有正常生物学功能的自体软骨组织[11]，为临床治疗软骨缺损提供了新的思路[2-3]。支架材料是组织工程的三要素之一，是种子细胞代谢活动的场所和连接细胞与组织的桥梁，在软骨组织工程中具有重要的作用。理想的软骨组织工程支架需满足以下要求[12-14]：①生物相容性好、免疫原性低；②合适的孔径大小和孔隙率；③有一定的力学强度，可维持细胞的三维生长；④降解速率适中，适配软骨再生的速率；⑤可模拟软骨微环境，促进体内、外构建软骨。

脱细胞基质是理想的支架材料来源[15]，在心脏瓣膜、真皮、膀胱、血管和肝脏等组织器官的构建中均已广泛应用[16-19]。然而，由于软骨组织非常致密，很难彻底脱净细胞，而残留细胞可能导致严重的免疫反应，因此ACM 的应用受到限制。研究表明，将软骨组织切成10 μm 薄片后再行脱细胞处理，可有效解决细胞残留问题[20]。但是，这些薄片无法制成多孔支架，难以复合细胞且不易加工塑形，不适宜三维多孔支架的制备。另有研究表明，应用CO2激光打孔技术在气管软骨表面打出点阵排列的激光微孔，可有效增加气管基质与脱细胞液体的接触面积，使脱细胞过程更加快速彻底[21]，但是激光微孔结构并不利于种子细胞的黏附和增殖，难以实现稳定高效的组织再生。本研究将软骨组织彻底粉碎后再行脱细胞处理，有效解决了脱细胞及免疫原性的难题。但是，ACM 粉末塑形困难，无法制成三维多孔支架。因此，我们以一定比例的GT 溶液作为辅剂，有效提升了ACM 交联性能，经冷冻干燥和EDC 交联，成功制备了基于ACM 的三维多孔支架，证实了ACM 制备三维多孔支架的可行性。我们还发现三维多孔支架的孔径、孔隙率与材料复合比例及冻干参数密切相关，而支架降解速率则与交联参数有关，这为我们研制孔径、孔隙率、降解速率均适合软骨再生的三维多孔支架提供了解决思路。

本研究将细胞-ACM 支架复合物体外培养8周，验证了ACM 体外再生软骨的可行性。组织学观察显示，细胞-ACM 支架复合物可体外再生均质、典型的软骨组织。这可能得益于①三维多孔支架的建立，有利于营养交换和物质运输，同时使软骨细胞在支架表面及内部均匀分布，促进了相对均质的软骨再生；②ACM 保留了软骨组织的天然成分，如Ⅱ型胶原、糖胺多糖等，为软骨再生提供了理想的微环境，促进了软骨细胞基质分泌和软骨形成[16]；③ACM提供了一些生长因子，如TGF-β、IGF 等，促进了软骨分化和成熟[17-18]。

综上所述，ACM 可制成适宜软骨再生的三维多孔支架，并可在体外成功构建组织工程软骨，是一种理想的软骨组织工程支架。今后，我们将系统地调控材料复合比例及浓度、冻干、交联参数，以精准控制孔径、孔隙率及降解速率，并结合3D 打印技术，实现支架三维形态的精确控制，满足临床患者需要的个性化定制组织工程软骨，为临床应用奠定基础。