环氧合酶-2、5-脂氧合酶及代谢产物对结肠腺瘤-腺癌发生发展的影响

方兴国，李波涛，刘模荣，王 红，刘华庆，文国荣

(1.遵义医科大学附属医院 消化内科, 贵州 遵义 563099； 2.遵义医科大学附属医院 病理科， 贵州 遵义 563099)

结肠癌在消化道恶性肿瘤中发病率仅次于胃癌，位居第二，近年来其发病率呈不断上升趋势，尤其是中青年更为明显。通过外科手术、放疗、化疗等综合治疗取得了一些进步，但总体5年生存率仍低于50%。为此，早期诊断和有效治疗成为临床医学面临的挑战。研究证实超过90%以上的结直肠癌是由腺瘤性息肉恶变而来，从正常的结肠粘膜→息肉→腺癌的系列演变过程中有多种肿瘤因子的参与。环氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)、5-脂氧合酶(5-lipoxygenase，5-LOX)表达升高及前列腺素E2(prostaglandinE2，PGE2)、白三烯B4(LTB4)生成的增多均参与多种肿瘤的发生、发展，使用环氧合酶-2、5-脂氧合酶抑制剂，可使环氧合酶-2、5-脂氧合酶及相应的下游代谢产物减少，起到抑制肿瘤的作用[1-3]。但它们共同在结肠腺瘤-腺癌演变中的作用了解甚少。本研究拟检测人的正常结肠粘膜、结肠增生性息肉、结肠腺瘤及腺癌组织中COX-2mRNA、5-LOX mRNA和蛋白质的表达情况，并通过二甲基肼(DMH)建立大鼠结肠腺瘤-腺癌模型，观察COX-2抑制剂塞来昔布(Celecoxib)、5-LOX抑制剂齐留通(Zileuton)对结肠腺瘤、腺癌发生发展的影响，以及相应结肠组织中的COX-2 mRNA、5-LOX mRNA表达和下游产物PGE2和LTB4浓度的变化，以研究COX-2、5-LOX对结肠腺瘤、腺癌发生发展的影响。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2016年10月至2017年10月在遵义医科大学附属医院消化内科行肠镜检查并经病理确诊的结肠标本(直径≥1cm)71例：增生性息肉25例，男12例，女13例，平均为(48±3)岁；腺瘤性息肉31例，男16例，女15例，平均为(46±2)岁；结肠腺癌15例，男7例，女8例，平均为(58±5)岁；正常结肠黏膜组织15例，男8例，女7例，平均为(50±2)岁。所选病例均平时身体健康，主要因出现消化道症状就诊行肠镜检查首次确诊的患者。SD大鼠(清洁级，雄性)55只，购于陆军军医大学实验动物中心(SCXK(渝)2012-0005)，体重180～220g。

1.2 实验试剂 二甲基肼(Sigma公司)；塞来昔布、齐留通(美仑生物技术有限公司);小鼠抗人β-actin抗体(Santa Cruz公司);驴抗山羊IgG(H+L)(碧云天生物科技研究所)；GTVisionTMⅢ抗鼠兔(基因科技上海有限公司)；山羊抗人5-LOX多克隆抗体和山羊抗人COX-2多克隆抗体(Santa Cruz公司)；山羊IgG-免疫组化试剂盒SABC即用型(博士德生物工程有限公司)；RT-qPCR转录试剂盒及相关引物(宝生物TaKaRa公司)；PGE2、LTB4检测的ELISA试剂盒(碧云天生物科技研究所)。

1.3 标本处理

1.3.1 结肠息肉及结肠癌 将肠镜下摘除的息肉、外科手术切除癌组织块及活检的正常结肠黏膜剪成大小约2 mm×2 mm×3 mm小块，等渗盐水反复冲洗，滤纸吸干表面水分装入EP管(每个标本分装成3～5管) 标记后放入液氮保存备用。剩下的组织放入福尔马林中送病理科确定组织学类型。

1.3.2 大鼠结肠肿瘤模型的构建及标本处理 选用SD大鼠55只，以二甲基肼(DMH)建立结肠腺瘤-腺癌模型。并随机分为5组：DMH组15只，干预组(DMH+Celecoxib组、DMH+Zileuton组、DMH+Celecoxib+Zileuton组，每组10只)，对照组10只。DMH组单纯予DMH(20 mg/kg)腹腔注射1次/周，并予 生理盐水灌胃，隔日1次；干预组在予DMH(20 mg/kg)腹腔注射1次/周的基础上，同时每组分别给予Celecoxib (50 mg/kg)、Zileuton (50 mg/kg)、Celecoxib (25 mg/kg)+Zileuton (25 mg/kg)联合灌胃，隔日1次；对照组向腹腔内注射生理盐水1次/周，并予生理盐水灌胃。每天观察记录大鼠生长活动情况。至实验18周开始，每2周每组随机处死大鼠1只取材观察结肠肿瘤生长情况，于22周全部处死。SD大鼠处死前禁食24h，用4%水合氯醛腹腔注射麻醉，然后将麻醉后的大鼠仰卧固定在大鼠解剖板上，腹壁备皮，常规消毒、铺洞巾，于剑突下沿腹壁切开约2.5cm纵向切口，并沿腹白线剪开腹壁组织，充分暴露腹腔，检查腹壁、脾脏、肝脏和腹腔淋巴结有无病变，检查有无肠梗阻及腹水，从小肠和结肠交界处及肛门缘剪下完整的结直肠，并沿结肠系膜剪开大鼠结直肠，用等渗冰生理盐水清洗血污，并用滤纸吸干表面水分，并称重(结肠湿重)，仔细观察大鼠结肠黏膜组织，如粘膜异常则取异常处3块，如黏膜无异常则肠腔远端、中段及近端各取3块；分别液氮速冻后置于-80℃冰箱保存和4%多聚甲醛固定保存。4%中性甲醛固定的标本经石蜡包埋、石蜡切片、HE染色、封片，病理切片分别由2位病理科医生盲法阅片。

1.4 方法

1.4.1 RT-qPCR法检测5-LOX、COX-2 mRNA的表达 用Trizol提取标本的总RNA，全波段酶标仪定量提取液中的RNA。按逆转录试剂盒操作说明将mRNA合成cDNA。相关引物序列分别为5-LOX(185bp)：上游引物5′AGATGGTAGAGTGCAGCCTGGAG 3′，下游引物，5′GACAATCTTG TTGGCCAGGTTCTTA 3′；β-actin(186bp)：上游引物 5′TGGCACCCAGCACAATGAA 3′，下游引物5′CTAAGTCATAGTCCGCCTAGA 3′。 COX-2(119bp)：上游引物5′CCAGCACTTCACGCATCAG 3′，下游引物5′GCTGTCTAGCCAGAGT TTCACC 3′；反应条件：95℃预变性8min， 1Cycle，PCR反应95℃ 15 s，60℃ 1min，40 Cycle。以5-LOX/β-actin、COX-2/β-actin比值×100分别表示5-LOX、COX-2 mRNA表达量。

1.4.2 Western-blot 法测定5-LOX、COX-2蛋白的表达 将留取的各组织标本放入新EP管，加入RIPA和PMSF.NaF充分裂解、匀浆，静置1 h，12 000 r/min离心30 min，留取上清液。用BCA蛋白定量法测定各组织蛋白含量。以40μg蛋白质为上样量，常规进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳转PVDF膜，脱脂奶粉封闭，分别加入山羊抗人5-LOX多克隆抗体(1∶500)，山羊抗人COX-2多克隆抗体(1∶500)，小鼠抗人β-actin抗体(1∶1 000)作为一抗，4℃过夜，洗膜，加入驴抗山羊IgG(H+L)(均为1∶1 000)和GTVisionTMⅢ抗鼠兔(1∶1 000)作为二抗，洗膜后ECL发光，X线胶片曝光，显影定影洗片，扫描Western印迹胶片，测定各组蛋白电泳带积分光密度值，以5-LOX/β-actin、COX-2/β-acting比值表示5-LOX、COX-2蛋白相对表达量。

1.4.3 免疫组织化学法检测5-LOX、COX-2蛋白的表达 取出组织块福尔马林中固定、石蜡包埋，制作切片。梯度脱水、去过氧化物酶、修复抗原、洗涤、封闭，羊抗人5-LOX多克隆抗体(1∶300) 和山羊抗人COX-2多克隆抗体(1∶300)作为一抗，PBS代替一抗作空白对照，4℃过夜，用PBS液洗涤3次，每次5 min，擦干水分而后加入山羊IgG—免疫组化试剂盒ABC即用型(1∶1 000)作为二抗，PBS洗涤去除二抗，DAB显色，苏木素复染冲洗，风干后封片，显微镜下观察，表达阳性的细胞为胞浆和(或)核膜出现黄色或棕黄色颗粒，在放大400倍显微镜下随机选择3个高倍视野，用全自动图像分析系统扫描拍照，用IPP软件测定各组织标本的积分光密度(IOD值)进行半定量分析。

1.4.4 ELISA法检测各组标本中PGE2/LTB4含量 将各组织标本剪碎后加入适量的PBS，充分匀浆使其充分裂解(操作在冰上进行)，冰上静置30 min，4 ℃ 12 000 r/min 离心20 min，收集各组标本上清液。按照BCA蛋白定量法测定各组织总蛋白含量。将各组织蛋白定量为终浓度为8.4 μg/μL，体积为25 μL的稀释液进行ELISA测试(按试剂盒操作说明操作), 分别计算出各组标本的PGE2和LTB4含量(μg/L)，每个标本做3个平行孔。

2 结果

2.1 人结直肠不同病理标本5-LOX、COX-2 mRNA及蛋白表达 免疫组织化学结果显示：正常结黏膜组织细胞中均见到少量的黄色或棕黄色颗粒；在增生性息肉中，见到少量到中等量的黄色或棕黄色颗粒；在腺瘤息肉中，见到中等量到大量的黄色或棕黄色颗粒，在腺癌组织细胞中，见到大量的黄色或棕黄色颗粒。对各组标本5-LOX、COX-2蛋白积分光密度后统计表明，正常黏膜组中表达最低，在腺癌组中表达最高，与其余各组之间比较差异均有统计学意义(P<0.05，见图1和表2)。

A:正常结肠黏膜; B:增生性息肉; C:腺瘤; D:腺癌；×400。图1 免疫组织化学检测中5-LOX、COX-2蛋白在各组织中的表达

RT-qPCR结果显示：正常结肠黏膜、结肠增生性息肉、结肠腺瘤息肉及结肠腺癌组织中5-LOX、COX-2 mRNA的相对表达量逐渐升高，以腺癌组织升高最为明显，各组之间比较差异具有统计学意义(P<0.05)。特别在腺瘤、腺癌组，与正常结肠黏膜、增生性息肉组相比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。腺癌组5-LOX、COX-2 mRNA表达明显高于腺瘤组，两相比较具有统计学意义(P<0.05，见表1)。

组别例数5-LOX mRNACOX-2 mRNA正常1512.72±0.165#23.80±3.96# 增生2557.21±18.22∗#128.21±25.95∗#腺瘤31235.20±40.07∗#296.73±38.39∗#腺癌15421.18±67.05∗ 324.20±45.62∗

* ：与正常组比较，P<0.05；#：与腺癌组比较，P<0.05。

Western-blot结果显示：正常肠黏膜组中出现无表达或弱表达，在腺瘤性息肉及腺癌组织表达明显增加，以腺癌组织中最为明显。与其余各组之间比较差异有统计学意义(P<0.05，见图2和表2)。

A:正常组;B:增生组;C:腺瘤组;D:腺癌组。图2 5-LOX、COX-2蛋白在不同组中的表达情况

2.2 各组大鼠结肠腺瘤-腺癌发生生长情况，5-LOX、COX-2 mRNA表达及PGE2、LTB4含量

2.2.1 结肠腺瘤-腺癌发生生长情况 实验组及干预组共45只大鼠，第3周DMH+Celecoxib组死亡1只，第4周DMH组死亡2只，出现腹壁溃烂，死亡率5.54%，尸检未发现结直肠黏膜病变，不计入有效动物。DMH+Celecoxib组、DMH+Zileuton组、DMH+Celecoxib+Zileuton组和DMH组大鼠逐渐出现食欲减退、体重增长缓慢、活动较前减少，且毛发稀疏、发黄，光泽差，后期有部分大鼠出现腹泻。对照组10只大鼠精神状态好，食欲可，活动佳，体重增长良好，毛发色泽光亮，无死亡。于18、20、22周分别处死并解剖各组大鼠，除对照组未见肿瘤生长外，其余各组大鼠结肠共发现肿瘤结节94枚，其中结肠腺瘤90枚，结肠腺癌4枚(见表3)。

组别例数5-LOX免疫组化Western-blotCOX-2免疫组化Western-blot正常158.722±3.655#0.158±0.045#6.100±1.078#0.212±0.065#增生2510.528±2.434∗#0.207±0.061#384.927±58.48∗#0.343±0.095∗#腺瘤316707.865±838.978∗#0.409±0.107∗#434.481±41.846∗#0.527±0.142∗#腺癌157603.092±1052.067∗0.672±0.154∗801.264±163.977∗0.626±0.158∗

*：与正常组比较，P<0.05；#：与腺癌组比较，P<0.05。

组别例数发生肿瘤大鼠数(只)腺瘤数(枚)腺癌数(枚)肿瘤直径(mm)结直肠湿重(g)DMH+Celecoxib 951503.52±0.96∗4.20±0.52∗#DMH+Zileuton 1061713.71±0.98∗4.55±0.64∗#DMH+Celecoxib+Zileuton 1051603.24±0.85∗4.09±0.50∗#DMH 13114234.28±1.025.13±0.49#对照1000003.51±0.49

*：与DMH组相比较，P<0.05；#：与对照组相比较，P<0.05。

2.2.2 各组大鼠5-LOX、COX-2 mRNA表达 RT- qPCR检测的结果显示COX-2、5-LOX mRNA在各组中均有表达，以DMH组最高、对照组较低。与其余各组间比较差异有统计学意义P<0.05，见表4)。

组别COX-2 mRNA5-LOX mRNADMH+Celecoxib 1.412±0.126∗# 2.266±0.041∗#DMH+Zileuton 1.995±0.211∗#1.551±0.031∗#DMH+Celecoxib+Zileuton 1.435±0.052∗#1.503±0.080∗#DMH 4.330±0.198∗3.632±0.130∗对照 1.058±0.07411.013±0.076

*：与对照组比较P<0.05；#：与DMH组比较P<0.05。

2.2.3 各组大鼠结肠标本中PGE2、LTB4含量比较 ELISA法检测结果显示各组结直肠组织中PGE2、 LTB4的含量均高于对照组(P<0.05)，以DMH组最高(P<0.05，见表5)。

组别PGE2含量(pg/L)LTB4含量(pg/L)DMH+Celecoxib568.72±17.68∗#452.59±8.82∗#ΔDMH+Zileuton 647.97±15.22∗#Δ 387.45±11.59∗# DMH+Celecoxib+Zileuton561.48±9.88∗#384.30±5.80∗# DMH 708.46±18.90∗ 567.42±10.21∗ 对照 362.10±5.48127.18±3.31

*：与对照组比较P<0.05；#：与DMH组比较P<0.05；Δ：与DMH+Celecoxib+Zileuton组比较P<0.05。

3 讨论

花生四烯酸、多不饱和脂肪酸酶代谢是通过环氧合酶和脂氧合酶2条途径来实现，产生具有多种生物活性的脂类终产物类花生酸类物质，这些活性物质在维持正常机体心血管系统动态平衡、消除炎症反应及免疫调节中起着重要作用[4-5]。研究表明，LOX 有5-LOX，8-LOX，12-LOX，15-LOX四型，其中15-LOX 可使肿瘤的发生与发展有关，相反8-LOX，12-LOX，15-LOX能促进细胞分化，抑制肿瘤细胞的增殖，具有抗癌作用[6-7]。 COX可分为COX-1、COX-2两个亚型。COX-1在生物体内恒定表达，参与维持有机体正常的生理功能，然而COX-2在正常组织中不表达或微量表达，其表达增加与炎症及肿瘤有关[8]。

5-LOX是体内催化花生四烯酸生成生物活性物质5-HETE和LTB4的关键酶，普遍存在于人的各类组织及血液细胞中，在正常组织中表达很甚微，主要分布于白细胞、巨噬细胞和肥大细胞中。当组织发生病变时表达增多，甚至过度表达。Tang 等[9]研究认为5-LOX与人体的卵巢、脑、心血管、肺、肝、胰腺等组织的许多疾病有关，其异常表达往往会促进疾病的发生和发展。近年来国内外多方面研究证实5-LOX表达上调参与多种肿瘤的发生和发展。Wen等[10]发现增加低氧的卵巢癌细胞中的5-LOX的代谢产物5-HETE和白三烯可促使肿瘤相关巨噬细胞的浸润。Zhou等[11]发现在胰腺癌组织中5-LOX表达增加水平与肿瘤淋巴结转移及肿瘤TNM分期相关。Wasilewicz等[12]采用免疫组织化学方法对111例不同病理组织学类型的结肠息肉研究中发现， 5-LOX表达与息肉的大小、高级别上皮内瘤变、绒毛状和管状腺瘤及组织学位置有关，认为5-LOX过渡表达在结肠癌致病过程中起着重要作用。Gounaris等[13]5-LOX抑制剂齐留通能抑制患息肉病老鼠肠息肉减少和息肉相关性炎症。本研究通过RT- qPCR、免疫组化染色及Western-blot检测5-LOX基因和蛋白在正常结肠黏膜、增生性息肉、腺瘤性息肉及腺癌组织中表达情况，其结果显示5-LOX从低表达逐渐升高，在腺瘤性息肉或腺癌组织中出现了过表达，以腺癌组织更为明显。在DMH结肠腺瘤-腺癌动物模型中，齐留通能抑制5-LOX mRNA高表达及LTB4产生，减少实验鼠腺瘤及腺癌发生及生长，与DMH组相比较差异具有统计学意义(P<0.05)。

COX-2催化体内的花生四烯酸生转化为前列腺素限速酶，研究证实COX-2如食管癌、结直肠癌、乳腺癌等多种肿瘤中存在表达升高或过度表达[14-16]。COX-2参与致癌过程主要跟下游产物PGE2有关，其机制主要包括[17]：①增加VEGF, bFGF, 和 PDGF含量促进血管生成；②增加bcl-2和Akt活性抑制细胞凋亡；③增加基质金属蛋白酶促进细胞转移；④降低细胞因子的产生和NK细胞活性进而降低免疫监视。使用塞来昔布作用于体外培养的胃癌细胞BGC-823以时间和剂量抑制细胞的增殖和降低COX-2表达及PGE2的分泌[18]。家族性腺瘤性息肉病患者在结肠切除后服用非甾体抗炎药舒林酸和COX-2抑制剂塞来昔布可减轻息肉病病情[19]。在我们的临床研究中发现鸦胆子油乳注射液联合5-氟尿嘧啶+四氢叶酸钙治疗中晚期大肠癌病人的血清中COX-2 和 PGE2水平是降低的[20]。本研究结果显示：COX-2 mRNA和蛋白在正常结肠黏膜中呈微表达或表达缺失，在增生性息肉、腺瘤息肉及腺癌中从表达均逐渐升高，在腺瘤组织和腺癌组织中过度表达。在DMH结肠腺瘤-腺癌动物模型中，塞来昔布能明显抑制COX-2 mRA表达及PGE2产生，减少实验鼠腺瘤及腺癌发生及生长，与DMH组相比较差异具有统计学意义(P<0.05)。

近年来，5-LOX和COX-2在肿瘤中的相互表达关系及其作用引起一些学者们的关注。Knab等[21]研究显示COX-2和5-LOX能促进胰腺癌细胞的增殖，且在能体外培养的胰腺癌细胞株中发现COX-2和5-LOX在基因和蛋白两个层面上表达均上调，当其受到阻断时，细胞增殖也随之停止。Ganesh等[22]通过外培养分别表达5-LOX和不同水平的COX-2的3种(HCA7, HT-29 & LoVo)结肠癌细胞株研究后认为在肿瘤致病过程中， COX-2和5-LOX途径同时并存，单用环氧合酶抑制剂疗效仍就不理想或无效。而在体外动物实验研究发现，5-LOX/COX双重抑制剂利克飞龙比同剂量的塞来昔布更有效的抑制小肠和结肠肿瘤的形成[22]。从本实验究结果中同样看到，5-LOX和COX-2在人体正常结肠黏膜、增生性息肉、腺瘤性息肉及腺癌组织中同时存在表达，并随着病理组织损害的加重(正常黏膜→腺瘤→腺癌)，其表达逐渐上调，在动物实验中，COX-2、5-LOX及其PEG2、LTB4在正常组织-结肠腺瘤-腺癌发生发展过程中表达逐渐增加，应用COX-2/5-LOX抑制剂，可使COX-2/5-LOX mRNA及代谢产物PGE2/LTB4的减少，抑制结肠细胞增殖，有抑制结肠腺瘤-腺癌发生发展的趋势。有趣的是，在联合使用塞来昔布、齐留通时，无论是5-LOX mRNA/COX-2 mRNA表达、PGE2/LTB4以及结肠腺瘤-腺癌的发生生长情况，与单用塞来昔布/齐留通组相比较，组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。但齐留通组中COX-2 mRNA表达、PGE2含量明显高于塞来昔布组及塞来昔布+齐留通组，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。同样，塞来昔布组中5-LOX mRNA表达、LTB4含量明显高于齐留通及塞来昔布+齐留通组，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。提示在5-LOX /COX-2代谢途径之间甚至与其他相关酶代谢通路之间存在交通及代偿机制。

综上所述，在致癌因素作用下，COX-2/5-LOX 能通过上调mRNA及蛋白表达，增加结肠粘膜组织中PGE2/LTB4含量，促进结肠腺瘤-腺癌的发生生长及恶变。COX-2或5-LOX抑制剂能部分抑制致癌剂所致的结肠腺瘤-腺癌的生长，即使二者联合使用也不能增加抑癌作用。提示COX-2/5-LOX代谢途径在结肠腺瘤-腺癌发生发展过程中具有一定的作用，二者具有协同性。这为结肠腺瘤-腺癌临床诊治提供实验依据。