高效液相色谱法测定发酵液中的柔红霉素含量

秦建萍

柔紅霉素是治疗急性白血病的强效蒽环类抗肿瘤抗生素。在柔红霉素发酵液中存在大量发酵杂质和一些结构十分相似的蒽环类化合物，对其进行分离和鉴定对柔红霉素的生产具有重要的指导意义。

1 仪器和试药

Shimadzu高效液相色谱仪及相应的化学工作站;GB-204型电子分析天平;KQ-5200DE数控型超声波清洗仪;柔红霉素对照品;柔红酮、双氢柔红酮、双氢柔红霉素、柔红霉素B、阿霉酮和阿霉素对照品;甲醇为色谱纯，草酸、碳酸氢钠、氯仿、无水硫酸钠、磷酸二氢铵和冰醋酸为分析纯，超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件及系统适用性试验

色谱柱：Kromasil-C18柱;流动相：甲醇-0.01摩尔/升磷酸二氢铵溶液-冰醋酸（62∶38∶0.2），流速：1.0毫升/分钟;柱温：30℃;检测波长：233纳米;进样量20微升。

2.2 样品的处理

对照品溶液的制备：精密称取柔红霉素对照品10.12毫克（91.0%），置50毫升容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，即得202.4微克/毫升的柔红霉素对照品贮备液，于4℃冰箱保存备用。

发酵液的预处理：取柔红霉素发酵液100毫升加入草酸3克，50℃加热1小时后冷却离心，吸取上清液4毫升加纯化水6毫升和6.6%碳酸氢钠溶液10毫升，混匀后加入2毫升氯仿，振摇，分取氯仿层加无水硫酸钠脱水后浓缩至干，加甲醇溶解后进行HPLC分析。

2.3 方法学验证

线性关系：分别精密吸取柔红霉素对照品溶液0.1、0.2、0.4、0.8、1.00毫升于10毫升量瓶中，加甲醇溶解，配制成2.024、4.048、8.096、16.192、20.24微克/毫升的溶液。按上述色谱条件分别进样20微升，以峰面积（A）对对照品质量浓度C（微克/毫升）进行线性回归，回归方程：

A=156.98C+2.911（r=0.9995）。

加样回收试验：为验证方法的可靠性，在已测定含量的发酵液中加入不同量的柔红霉素标准品，由测得结果计算回收率，结果见表1，平均回收率为99.93%，RSD为1.89%。

3 结论

本文以甲醇-0.01摩尔/升磷酸二氢铵溶液（pH4.5）-冰醋酸（62∶38∶0.2）为流动相时柔红霉素峰形良好，分离度高。笔者采用柔红霉素发酵液酸化后萃取法除去干扰杂质后测定发酵液中柔红霉素含量的高效液相色谱法，为进一步研究奠定基础。