亮氨酸对大鼠肝部分切除术后肝再生的影响

林建华，洪重，周斌

（温州医科大学附属第二医院 肝胆外科，浙江 温州 325027）

肝部分切除术是外科治疗肝癌的重要手段，但大量肝实质切除会导致肝功能衰竭、残肝再生障碍，造成很高的并发症及病死率，严重影响了肝癌的治疗效果。如何促进肝癌患者术后肝再生，缩短康复时间是当前肝胆外科研究的热点和难点问题。本研究用不同亮氨酸浓度的氨基酸配方对肝部分切除术后大鼠进行添加喂养，探讨其对残肝再生能力的影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组雄性SD大鼠18只，温州医科大学实验动物中心提供，体质量250～300 g，实验动物许可证号:SYXK（浙）2015-0009，按Higgins法切除肝左叶和中叶（约占全肝的70%），同时行胃造瘘术。术后随机分为3组，分别经胃造瘘管给予平衡氨基酸（8.5%乐凡命，无锡华瑞制药有限公司BAA组）、支链氨基酸（杭州海力生公司，BCAA组）、亮氨酸（杭州海力生公司，Leu组），每组6 只。每日供给等氨基酸量1 g/kg，自由进食及饮水，喂养7 d后处死动物，收集肝脏标本，处理后备测。3组氨基酸成分差异见表1。

表1 3组氨基酸添加量的比较（/kg体质量）

1.2 方法

1.2.1 残肝/体质量比:记录大鼠每日体质量，7 d后处死，取出残肝，0.9%氯化钠溶液漂洗后称质量，计算残肝/体质量比。

1.2.2 肝细胞增殖细胞核抗原Ki-67和PCNA表达:采用免疫组织化学二步法，检测肝组织标本石蜡切片，计算Ki-67和PCNA阳性肝细胞数。由不参与实验分组的病理科医师在高倍显微镜视野下，计数1 000个肝细胞中阳性染色细胞数，以百分数表示。

1.3 统计学处理方法采用SPSS20.0软件进行统计分析。计量资料以±s表示，多组比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠肝切除手术前后体质量变化3组大鼠术后早期体质量均下降，但Leu组和BCAA组在手术后期体质量逐渐回升，接近术前状态，而BAA组则在体质量下降后处于维持状态，见图1。

图1 3组大鼠体质量变化曲线

2.2 亮氨酸对肝切除大鼠残肝/体质量比的影响

以BAA组为对照，喂养7 d后Leu组的残肝/体质量比明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05），BCAA组有增高趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）；Leu组与BCAA组比残肝/体质量比升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

图2 3组大鼠肝部分切除术7 d后残肝/体质量比

2.3 亮氨酸对肝切除大鼠Ki-67和PCNA表达的影响与BAA组相比，喂养7 d后BCAA组和Leu组的Ki-67和PCNA阳性肝细胞计数均显著升高（P＜0.05），说明其残肝细胞分裂增殖活跃，再生能力增强，且Leu组Ki-67和PCNA阳性肝细胞计数较BCAA组升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图3。

3 讨论

肝脏具有强大的再生能力，可以满足适当的手术切除，但过多的肝切除会导致肝功能失代偿，影响术后恢复，甚至出现死亡。特别在肝硬化肝癌患者，肝再生能力已明显受损，残肝代偿能力将直接影响预后，是手术治疗成败的关键。

诱导肝再生可有不同的途径，如肝细胞生长因子、激素、细胞因子（TNF、IL-6）、营养因素等[1-2]。其中营养治疗简单、经济、易于获得。肝切除术后氨基酸代谢需求增加，而补充氨基酸可促进肝再生，限制饮食蛋白则起抑制作用[1]。然而并非所有氨基酸是必需的，目前尚未明确的是多大的蛋白供给量以及怎样的氨基酸成分配比对肝脏修复最为有利。

支链氨基酸是一组特殊氨基酸，主要在骨骼肌内代谢，因而有利于减轻肝脏负担。除提供营养底物外，支链氨基酸可通过促进蛋白质合成、刺激肝细胞生长因子产生、减少细胞凋亡、代谢生成谷氨酰胺等多种途径利于肝再生的进行[3-4]。近来在大鼠肝移植模型中研究发现，支链氨基酸可刺激肝外骨髓干细胞转化生成新的肝细胞，从而促进肝再生[5]。支链氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸3种成分，研究表明，支链氨基酸促进蛋白质合成的作用主要归功于亮氨酸[6]，而与其他2种成分无关。同样，体外细胞实验发现[7]，在刺激产生肝细胞生成因子作用方面也主要依赖于亮氨酸，缬氨酸、异亮氨酸则没有效果。所以有研究[8]指出强化亮氨酸的营养添加比强化支链氨基酸可能更加有效，作者前期研究结果也证实了这一点[9]。

图3 3组大鼠肝部分切除术7 d后肝细胞Ki-67、PCNA免疫组织化学染色（×200）及阳性细胞计数比较

本研究结果显示，肝部分切除大鼠术后给予亮氨酸添加喂养，残肝/体质量比、肝细胞的PCNA和Ki-67 阳性计数均较平衡氨基酸组有显著增加，说明肝细胞分裂增殖活跃，再生能力增强，且作用跟亮氨酸的喂养量成正比。亮氨酸作为一种特殊的氨基酸，不仅提供营养底物，更可能是一种营养信号因子，通过激活细胞信号传导途径促进蛋白质的合成。目前认为亮氨酸的作用主要与哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）激酶途径活化有关[6-7，10-11]，通过进一步磷酸化其下游的4EBP1和S6K1等信号分子在蛋白翻译起始阶段起作用，而mTOR信号通路激活则可能通过多种方式促进肝细胞的再生[1，7，12-13]。

我们认为，较之平衡氨基酸，亮氨酸更有利于肝部分切除大鼠术后残肝的再生，且作用优于支链氨基酸。但过高的亮氨酸喂养是否会给机体带来不良影响以及亮氨酸促进肝再生的具体作用机制等问题有待进一步研究。