莪术醇对人卵巢癌SKOV3细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的影响

2019-10-21戴凌虹孙云陈祥艳

温州医科大学学报 2019年10期

戴凌虹，孙云，陈祥艳

（温州市中医院妇产科，浙江温州 325000）

卵巢癌是女性中最常见的恶性肿瘤之一，手术是其首选治疗方案，但高转移率导致难以清除转移病灶，对临床预后产生较差影响[1]。经手术后放、化疗患者有多达75%复发，且5年生存期仅为30%～40%[2-3]。中草药综合治疗卵巢癌的优势在临床中日益突显，不仅可特异性杀伤肿瘤细胞，而且对正常组织伤害小，从中草药中寻找安全有效的抗肿瘤药物已成为研究热点。莪术醇是从姜黄根茎中提取的一种黄酮类小分子化合物，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等功效[4]。莪术醇能诱导多种癌细胞凋亡，但目前对莪术醇作用于卵巢癌SKOV3细胞的具体机制研究甚少。本研究旨在观察莪术醇对SKOV3细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的影响，并以PI3K/AKT通路为靶点，探讨莪术醇的作用机制，为其临床应用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1 药品:莪术醇，相对分子质量为236.35 kDa，质量分数＞98%，购自中国食品药品检定研究院，批号为111463-201708，于使用前用无水乙醇溶解，并用培养基稀释成所需浓度。

1.1.2 试剂与主要仪器:卵巢癌SKOV3细胞株购自武汉普诺赛生命科技有限公司；DMEM/F12培养基、胎牛血清、胰酶均购自美国Gibco公司；LY294002购自美国Sigma公司；兔抗鼠PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT一抗购自英国Abcam公司；CCK-8试剂盒、羊抗兔二抗购自武汉博士德公司；RIPA裂解液、BCA试剂盒购自美国Thermo公司；CO2培养箱、MK3型酶标仪购自美国Thermo公司；低温高速离心机购自德国Eppendorf公司；流式细胞仪购自美国BD公司；凝胶成像分析仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养:SKOV3细胞常规培养于5%的CO2、饱和湿度、37 ℃恒温培养箱中，培养基为含10%胎牛血清和1%青霉素、链霉素的DMEM/F12培养基，每隔2～3 d胰酶消化并传代。在SKOV3细胞生长稳定、呈对数期时用于实验。

1.2.2 CCK-8 法检测细胞增殖抑制率:取对数生长期的SKOV3细胞，胰酶消化后，调整细胞浓度至5×107个/L，每孔100 μL分别接种于2 块96孔板中。待细胞完全贴壁后，弃去培养液。配制终浓度为5、10、25、50、100 μmol/L的莪术醇溶液，每孔加入100 μL，每组设置6个复孔。于培养箱中分别培养24、48 h后，每孔加入5 μL的CCK-8溶液继续培养3 h，用酶标仪在450 nm下检测OD值，并计算细胞增殖抑制率，分析莪术醇对SKOV3细胞的IC50值（48 μmol/L）。0 μmol/L莪术醇为对照组。

1.2.3 细胞划痕实验检测迁移能力:取对数生长期的SKOV3细胞，胰酶消化后，接种至6孔板内，待细胞长至80%左右时，每孔垂直于6孔板划3条平行线，造成细胞划痕；吸弃孔内培养基，PBS洗涤，加入无血清培养基，分为药物组和对照组，每组3个复孔；药物组给予终浓度为48 μmol/L的莪术醇溶液，0 μmol/L莪术醇为对照组；培养箱中继续培养，分别记录药物干预6、12、24 h后的细胞划痕愈合情况。

1.2.4 Transwell小室法检测侵袭能力:取对数生长期的SKOV3细胞，溶液干预24 h后，胰酶消化，调整细胞浓度为2×105个/mL，取200 μL接种于Transwell小室上层，将其置于灭菌的24孔板，小室下层加入培养基，常规培养24 h；弃去培养基，取出小室基底膜，用甲醇固定10 min，苏木精染色，随机取10个视野，高倍镜下记录穿膜的细胞数并统计分析。

1.2.5 流式细胞术检测凋亡率:取对数生长期的SKOV3细胞接种于6孔板中，加入药物干预处理24 h，收集上清液并用PBS洗涤2 次，收集全细胞，预冷的PBS洗涤，沉淀用Binding Buffer重悬，依次加入Annexin V-FITC、Propidium Iodide，混匀，室温下避光反应5～15 min，流式细胞仪上机检测，采用Cell Quest软件分析细胞凋亡率，重复3次。

1.2.6 Western blot法检测相关蛋白表达: 收集细胞样本，加入一定量RIPA液裂解，于4 ℃、12 000 r/min条件下离心10 min，取上清液为细胞蛋白样本，测定总蛋白含量。制备分离胶和浓缩胶，蛋白上样跑电泳，完成后转膜，5%脱脂奶粉室温下封闭1 h，加入稀释后的一抗，4 ℃冰箱孵育过夜。次日用TBST液洗涤条带3次，每次15 min，加入二抗室温下孵育4 h，洗涤，显影。应用ImageJ软件分析条带灰度值，计算蛋白相对表达量。

1.3 统计学处理方法采用SPSS19.0软件进行数据分析，计量资料用±s 表示，计数资料用百分率表示。2组间比较用t 检验，多组间比较用单因素方差分析；两两比较方差齐时采用LSD检验法，方差不齐时采用Dunnett’s T3检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 莪术醇对SKOV3细胞增殖的影响莪术醇浓度为10 μmol/L时对SKOV3细胞有较为明显的增殖抑制作用，且抑制率随着药物浓度的增加而增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；但同浓度下药物干预48 h与干预24 h比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见图1。计算24 h时莪术醇对SKOV3细胞的IC50值约为48 μmol/L，取该浓度进行后续实验。

2.2 莪术醇对SKOV3细胞迁移的影响与对照组比较，莪术醇干预12 h后的细胞划痕面积比明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；24 h时对照组细胞划痕面积比显著缩小，细胞愈合明显，而在莪术醇干预完成后，划痕面积比缩小趋势较缓，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。见表1。

2.3 莪术醇对SKOV3细胞侵袭的影响Transwell细胞体外侵袭实验结果表明，对照组跨膜细胞数明显多于莪术醇组跨膜细胞数，差异有统计学意义（P＜0.01），见表2。

2.4 莪术醇对SKOV3细胞凋亡的影响与对照组比，莪术醇干预24 h后SKOV3细胞凋亡率明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01），见表2和图2。

2.5 莪术醇对SKOV3细胞PI3K/AKT通路的影响与对照组比，莪术醇组SKOV3细胞PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达均有明显的下降，但对磷酸化蛋白表达的影响明显强于总蛋白，差异有统计学意义（均P ＜0.05）；给予PI3K/AKT通路特异性阻断剂LY294002干预后，莪术醇组与莪术醇联合LY294002组间PI3K、AKT表达无明显变化，2组差异无统计学意义（P＞0.05）；但与莪术醇组比，莪术醇联合LY294002组p-PI3K、p-AKT表达下降，差异有统计学意义（P＜0.01）。见图3。

图1 不同浓度的莪术醇对SKOV3细胞的增殖抑制作用

表1 莪术醇对SKOV3细胞迁移率的影响（每组n=3，±s，%）

与对照组比:aP ＜0.05，bP ＜0.01

表2 莪术醇对SKOV3细胞侵袭和凋亡的影响（每组n=3±s）

与对照组比:aP ＜0.01

图2 流式细胞术检测各组细胞凋亡情况

3 讨论

据国家癌症中心资料，我国每年卵巢癌新发病例数约为5.21万人，死亡病例数约为2.25万人，死亡率位居妇科恶性肿瘤的首位[5]。手术加放、化疗是临床治疗卵巢癌的主要手段，但存在易复发、预后差、副作用大等缺点；中药在恶性肿瘤的治疗上具有独特的优势，目前肿瘤疾病的中西医结合治疗法受到医学界越来越多人的关注与认可[6]。莪术醇作为我国传统中药莪术的主要抗肿瘤成分，具有抑制肝癌、结肠癌、胃癌、宫颈癌等多种癌细胞增殖的作用[7]。有关莪术醇抑制卵巢癌细胞增殖并诱导凋亡的研究已有文献报道[8]，但对癌细胞迁移、侵袭及相关调节机制的报道甚少，且其调节机制在分子水平也没有详细阐明。

本研究从不同时间不同浓度观察莪术醇对人卵巢癌SKOV3细胞增殖抑制效果，结果发现，莪术醇能明显抑制SKOV3细胞增殖，并呈一定的剂量依赖性，但干预48 h与24 h对比差异无统计学意义，并不呈现明显的时间依赖性。根据莪术醇干预SKOV3细胞24 h时的抑制率结果，计算IC50值约为48 μmol/L，考虑到大于该浓度后莪术醇的抑制率增长缓慢，故后续实验均采用48 μmol/L莪术醇干预，时间为24 h。

恶性肿瘤治疗的难点之一就是肿瘤细胞的迁移侵袭造成体内转移，为肿瘤治疗造成很大阻碍，而肿瘤细胞的迁移侵袭是在细胞具有增殖能力的前提下进行的，本研究在明确莪术醇增殖抑制效果的基础上，通过划痕实验和Transwell小室实验发现，莪术醇能显著抑制SKOV3细胞的迁移和侵袭。PI3K/AKT信号通路是细胞内的重要调节通路，参与调节细胞生长、代谢、凋亡、转移等，在多数肿瘤细胞内均存在表达失调[9]。研究证明，PI3K/AKT信号通路与卵巢癌的发生发展密切相关，是卵巢癌发病机制研究及治疗药物筛选的关键靶点之一[10]。PI3K/AKT激活后通过调节胞质内凋亡相关蛋白的活性发挥抗凋亡作用，因此，抑制PI3K/AKT通路可以阻止肿瘤细胞的生长或发展[11-12]。本研究发现，莪术醇能使SKOV3细胞PI3K、AKT总蛋白表达降低，同时显著降低其磷酸化程度，表明其主要是通过调控PI3K/AKT磷酸化，抑制该通路激活而发挥作用；本研究进一步采用PI3K/AKT通路特异性阻断剂LY294002联合干预后发现，莪术醇能与阻断剂展现出良好的协同增效作用，说明莪术醇抑制SKOV3细胞增殖、诱导其凋亡的作用与调控PI3K/AKT通路有关。