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60Co-γ辐照对丹香清脂颗粒中5种有效成分含量的影响

2019-10-19康江丽

中国药业 2019年20期
关键词:丹参酮酚酸川芎

康江丽,吴 雯

(中国人民解放军联勤保障部队第900医院,福建 福州 350000)

丹香清脂颗粒是由丹参、川芎、桃仁、降香、大黄等8味中药材组方的中药复方制剂,属国家基本药物,收载于2015年版《中国药典(一部)》,有活血化瘀、行气通络功效,临床主要用于治疗高脂血症属气滞血瘀证者[1]。丹参和川芎为方中君药,有活血、化瘀、活络功效,丹参主要成分有丹参酮ⅡA和丹酚酸B[2-3],川芎主要成分为藁本内酯、洋川芎内酯A和洋川芎内酯I等[4-5]。该颗粒现行法定标准中仅有川芎、大黄和莪术的薄层色谱鉴别项及丹参酮ⅡA的含量测定项,用于其质量控制稍显不足。

丹香清脂颗粒制作工艺复杂,为保证制剂成品质量,避免在加工和储存过程中受到细菌污染,须采取灭菌措施。60Co-γ辐照灭菌法是以γ射线电离辐射产生的高能射线,通过物理和生物效应,破坏细菌中蛋白质的合成,从而达到杀菌效果,穿透力强、操作简单、灭菌效果好,可在常温下进行[6-7]。本研究中采用60Co-γ辐照丹香清脂颗粒进行灭菌,并建立高效液相色谱(HPLC)法同时测定丹香清脂颗粒中丹参酮ⅡA、丹酚酸B、藁本内酯、洋川芎内酯A和洋川芎内酯I的含量,分别考察2,5,8 kGy 3个辐照剂量对上述成分含量的影响,确定最佳有效辐照强度,为丹香清脂颗粒生产工艺中的灭菌提供参考。现报道如下。

图1 高效液相色谱图

1 仪器与试药

1.1 仪器

1260型高效液相色谱仪,包括G1311A四元梯度泵、G1329A自动进样器、G1314B-DAD检测器、G1316A柱温箱、Agilent-Chemistation数据处理系统(美国Agilent公司);AUW-220D型电子分析天平(日本Shimadzu公司);中药粉碎机(浙江屹立工贸有限公司);60Co-γ辐照装置(深圳市金鹏源辐照技术有限公司);KQ-250DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);LRH-150B型生化培养箱(广东省医疗器械厂);ZOZ-AB型电热恒温干燥箱(上海跃进医疗器械厂);YJ-875型医用净化工作台(苏州净化设备厂)。

1.2 试药

丹香清脂颗粒(吉林敖东集团大连药业股份有限公司,批号分别为 170915,171209,180123,180217,180321,180511,180622,规格为每袋 10 g);丹参酮ⅡA对照品(批号为110766-201721,含量 99.5%)、丹酚酸B对照品(批号为 111562-201716,含量 94.1%)、藁本内酯对照品(批号为111737-201608,含量 100.0%),均购于中国食品药品检定研究院;洋川芎内酯A对照品(批号为62006-39-7,含量97.2%),洋川芎内酯I对照品(批号为94596-29-5,含量97.5%),均购于上海纯优生物科技有限公司;甲醇、乙腈均为色谱纯,其余试剂均为分析纯,水为超纯水。

2 方法

2.1 色谱条件

色谱柱:Agilent Zorbax-C18柱(250 mm ×4.6 mm,5 μm);流动相:乙腈(A)-0.5% 磷酸溶液(B),梯度洗脱(0~10 min时 42%A,10~25 min时 42%A→68%A,25~40 min时 68%A→88%A,40~50 min时 88%A→42%A);流速:1.0 mL /min;检测波长:280 nm(0 ~39 min),268 nm(40 ~50 min);柱温:30 ℃[8-9]。

2.2 溶液制备

混合对照品溶液:分别称取各待测成分对照品适量,精密称定,分别加80%甲醇制成每1 mL含丹参酮ⅡA1.2244 mg、丹酚酸 B 1.5125 mg、藁本内酯 0.6537 mg、洋川芎内酯A 0.5963 mg、洋川芎内酯I 0.4127 mg的混合对照品溶液,摇匀,低温避光贮存。

供试品溶液:取装量差异项下样品,研匀,取约2.5g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入80%甲醇50 mL,密塞,称定质量,超声处理(功率500 W,频率40 kHz)45 min,放冷,再称定质量,用80%甲醇补足减失的质量,经0.45 μm微孔滤膜滤过,取续滤液,即得。

阴性对照溶液:按丹香清脂颗粒处方和工艺制备缺丹参、川芎的阴性样品,按供试品溶液制备方法制备阴性对照溶液。

2.3 方法学考察

系统适用性试验:取上述混合对照品溶液、供试品溶液各适量,按拟订色谱条件进样测定,记录色谱图,详见图1。理论板数按各待测成分峰计均大于3000,分离度均大于1.5,基线分离良好。

线性关系考察:精密量取混合对照品溶液5 mL,置50 mL容量瓶中,加80%甲醇定容,精密量取1,2,5,10,15,20,25 μL,按拟订色谱条件进样测定,记录峰面积。以待测成分进样量(,μg)为横坐标、峰面积(Y)为纵坐标进行线性回归,得回归方程与线性范围。详见表1。

表1 回归方程、线性范围及定量限(n=7)

定量限考察:分别精密量取混合对照品溶液适量,倍比稀释,按拟订色谱条件进样测定,以信噪比(S/N)10∶1计算定量限。结果见表1。

精密度试验:取混合对照品溶液适量,按拟订色谱条件连续进样测定6次,记录峰面积。结果丹参酮ⅡA、丹酚酸B、藁本内酯、洋川芎内酯A和洋川芎内酯I峰面积的RSD分别为 1.21% ,1.03% ,1.12% ,0.82% ,0.89%(n=6),表明仪器精密度良好。

稳定性试验:取供试品(批号为180321)溶液适量,分别于室温下放置 0,3,6,9,12,18,24 h 时按拟订色谱条件进样测定,记录峰面积。结果丹参酮ⅡA、丹酚酸B、藁本内酯、洋川芎内酯 A和洋川芎内酯 I峰面积的RSD分别为 1.13% ,0.90% ,1.02% ,0.83% ,0.71%(n=7),表明供试品溶液室温放置24 h内基本稳定。

重复性试验:精密称取样品(批号为180321)6份,依法制备供试品溶液,再按拟订色谱条件进样测定,记录峰面积并计算含量。结果丹参酮ⅡA、丹酚酸B、藁本内酯、洋川芎内酯 A和洋川芎内酯 I平均含量分别为1.1048,1.3622,0.2413,0.1927,0.1035 mg /g,RSD分别为 1.31% ,1.01% ,1.10% ,0.84% ,0.91%(n=6),表明方法重复性良好。

加样回收试验:取已知含量的样品(批号为180321)适量,共6份,分别加入低、中、高质量浓度的待测成分对照品溶液,依法制备供试品溶液,再按拟订色谱条件进样测定,记录峰面积并计算回收率。结果见表2。

表2 加样回收试验结果(n=6)

2.4 样品含量测定

取7批样品各适量,分别以2,5,8 kGy剂量60Co-γ辐照,依法制备供试品溶液,再按拟订色谱条件进样测定,平行3次,记录峰面积并计算样品含量。数据以SPSS 19.0统计学软件分析,行t检验,P<0.05为差异有统计学意义。结果见表3。

表3 样品含量测定结果(mg/g,n=6)

3 讨论

藁本内酯、洋川芎内酯A和洋川芎内酯I属苯酞类成分,易受氧化、水解、光解、异构化等影响发生结构改变。藁本内酯的化学结构为不饱和的苯酞结构,3位上有活泼的丁烯基,均为化学不稳定性因素[10];洋川芎内酯A含有的不饱和环易通过脱氢反应形成更加稳定的苯环结构[11]。

本试验中取供试品溶液及各对照品溶液进行全波长扫描,结果显示,丹参酮ⅡA、丹酚酸B在268 nm波长处有最大吸收,藁本内酯、川芎内酯A和川芎内酯I在280 nm波长处有最大吸收,故选择2个波长进行测定。在流动相的选择中,分别尝试了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-冰醋酸溶液、乙腈-磷酸溶液4种不同体系。最后发现,以乙腈-0.5%磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱时,各色谱峰之间分离良好,杂质峰无干扰。提取方法考察了回流提取、超声提取,考虑到超声提取简单方便且提取完全,故选用超声提取法,并通过比较不同提取溶剂体积及不同提取时间下超声提取法对5种成分的提取率,最终确定为用80%甲醇作溶剂超声提取45 min。本试验中通过考察60Co-γ辐照对丹香清脂颗粒中5种有效成分含量的影响,发现辐照剂量控制在不超过5 kGy时,能对丹香清脂颗粒进行有效消毒灭菌,同时不影响制剂质量。该结论可为对该类药物进行60Co-γ辐照灭菌提供参考。

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