高效液相色谱法测定山楂药材和小儿麦枣咀嚼片中枸橼酸含量

吴 蓉，范胜莲

（四川省攀枝花市中西医结合医院，四川 攀枝花 617000）

山楂、麦芽、神曲俗称“焦三仙”，其中山楂为蔷薇科植物山里红Crataegus pinnatifidaBge.Var.major N.E.Br.或山楂Crataegus pinnatifidaBge.的干燥成熟果实。小儿麦枣咀嚼片由山药、大枣、山楂和麦芽4味药材经现代工艺制成，收载于国家食品药品监督管理局药品标准 WS-10409（ZD-0409）-2002-2012Z，临床主要用于治疗小儿脾胃虚弱、食欲不振、食积不化，有健脾和胃作用[1-3]。处方中的山楂和麦芽有健胃消食、行气散瘀、去积滞、助消化功效，山楂和大枣具有补脾养胃、生津益肺、益气补中、养血安神功效[4-6]。山楂中发挥消食作用的主要是成分是有机酸，其中以枸橼酸的含量最高[7-9]。2015年版《中国药典（一部）》山楂项下总有机酸的测定是以枸橼酸的含量计算，但采用的滴定法在滴定过程中影响因素较多，且样品颜色较深，不易准确测定。本试验中参考文献[10-15]对其测定方法进行了改进，建立了高效液相色谱（HPLC）法测定山楂药材和小儿麦枣咀嚼片中枸橼酸的含量。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Ultimate3000型高效液相色谱仪，包括全自动进样器、恒温柱温箱、VWD检测器、变色龙Chromeleon7工作站（美国赛默飞世尔公司）；AE240型电子天平（瑞士梅特勒-托利多仪器公司）；KQ-500DE型数控超声波清洗器（江苏昆山超声仪器有限公司）。

1.2 试药

山楂药材（批号分别为 181012，180502，180901，181203，190101）来源于攀枝花市中西医结合医院中药房，经该院范胜莲副主任中药师鉴定为正品。小儿麦枣咀嚼片（葵花药业集团＜佳木斯＞有限公司，批号分别为201801009，201811002，201812005，规格为每片 0.45 g）；枸橼酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号为100396-201102，含量 99.9% ）；甲醇为色谱纯，磷酸二氢铵、磷酸均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Welch-C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相:甲醇（A）-0.5%磷酸二氢铵（B，磷酸调pH至2.8）溶液（5 ∶95，V／V）；流速:0.8 mL ／min；柱温:25 ℃ ；检测波长:210 nm；进样量:10 μL。

2.2 溶液制备

对照品溶液:称取在105℃干燥2 h后的枸橼酸对照品11.98 mg，精密称定，置10 mL容量瓶中，加水定容，作对照品贮备液；精密吸取2 mL置5 mL容量瓶中，加甲醇定容，作对照品溶液（每1mL含枸橼酸0.4792mg）。

供试品溶液:取山楂药材（批号181012），粉碎，过3号筛，称取粉末0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加水50 mL，称定质量，静置2 h，超声（功率270 W，频率40 kHz）处理30 min，再次称定质量，用水补足减失的质量，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，作供试品溶液Ⅰ。取小儿麦枣咀嚼片（批号201801009）10片，研细，混匀，称取粉末3.0 g，精密称定，后同法操作，得供试品溶液Ⅱ。

阴性对照溶液:按小儿麦枣咀嚼片处方量的1／10制备缺山楂药材的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照溶液。

2.3 方法学考察

专属性试验:精密吸取2.2项下4种溶液各10 μL，按2.1项下色谱条件进样测定，结果阴性对照溶液在与对照品溶液相同保留时间处无色谱峰（图1），说明该方法的专属性强，理论板数以枸橼酸峰计不低于9000，分离度均大于1.5。

线性关系考察:取对照品贮备液作为5号对照品溶液；精密吸取2 mL，置10 mL容量瓶中，作为4号对照品溶液；然后精密吸取对照品溶液各1 mL，分别置25，50，100 mL容量瓶中，作为3号、2号、1号对照品溶液。分别吸取上述 1～5号对照品溶液各 10 μL，按 2.1项下色谱条件进样测定，以进样量（，ng）为横坐标、相应峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y=0.0834+3.7633，r=0.9999（n=5）。结果表明，枸橼酸进样量在47.92～11980.00 ng范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验:分别取上述1号、3号和5号对照品溶液，各连续进样6次，记录峰面积。结果的RSD分别为2.06%，1.22%，0.42%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验:取供试品溶液，室温下分别放置0，1，2，4，8，12，24h时进样测定，记录峰面积。结果山楂药材和小儿麦枣咀嚼片中枸橼酸峰面积的RSD分别为2.83%和2.19%（n=7），表明供试品溶液室温下放置24h内稳定。

重复性试验:分别取山楂药材（批号181012）和小儿麦枣咀嚼片（批号201801009），依法同时制备6份供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，并计算样品含量。结果的RSD分别为 0.78%和 1.24% （n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验:称取已知含量的山楂药材粉末共6份，每份0.25 g，同时称取已知含量的小儿麦枣咀嚼片6份，每份1.5 g，精密称定，分别加入适量枸橼酸对照品溶液，依法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，计算样品中枸橼酸的加样回收率。结果见表1。

图1 高效液相色谱图

表1 枸橼酸加样回收试验（n=6）

2.4 样品含量测定

取不同批次的2种样品，依法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，结果见表2。并将结果与原标准中的滴定法进行比较，2种方法测得结果的RSD均小于3%，表明该方法可行。

表2 山楂药材和小儿麦枣咀嚼片中枸橼酸含量测定结果

3 讨论

3.1 供试品制备方法选择

枸橼酸是极性较大的有机酸，通常应采用正相色谱柱进行分离，采用反相色谱柱分离时具有出峰速度快、不易受溶剂峰影响的优点，且枸橼酸易溶于水，因此在制备供试品时首先参考山楂药材中枸橼酸含量测定的处理方法。采用水作为提取溶剂进行浸泡，由于浸泡所需时间长，因此本试验中在浸泡的基础上又进行超声处理，提高了提取效率。分别采用乙醇、50%甲醇和水3种溶剂，结果发现水的提取效率最高，后采用正交试验对提取溶剂的量、提取时间、超声功率等因素进行综合考察，最后确定样品取样量为3.0 g，浸泡2 h后再超声30 min为最佳提取方法。

3.2 检测波长及流动相选择

在190～300 nm波长范围内对枸橼酸对照品溶液进行扫描，结果发现在210 nm波长附近有最大吸收，因此选择210 nm作为检测波长。选择流动相时先后采用甲醇 -0.1%磷酸溶液（5 ∶95，V／V）、乙腈 -0.2%磷酸二氢铵（磷酸调pH至3.0）溶液、甲醇-0.5%磷酸二氢铵（磷酸调 pH 至 2.8）溶液（5 ∶95，V／V）等进行洗脱。结果以甲醇-0.1%磷酸溶液为流动相时，峰形不对称，拖尾严重；乙腈-0.2%磷酸二氢铵（磷酸调pH至3.0）溶液作流动相时出峰较快，溶剂峰干扰较大。由于枸橼酸在水溶液中很容易电离，产生多峰现象，为了使其尽可能地以分子形式存在，一般在流动相中加酸来抑制枸橼酸的解离。以本试验中选择的甲醇-0.5%磷酸二氢铵（磷酸调 pH 至 2.8）溶液（5 ∶95，V／V）为流动相时，枸橼酸的色谱峰分离较好，峰形对称。且以缓冲液作为流动相易控制其pH，从而保证样品的重复性。

综上所述，本研究中建立的HPLC法测定结果与原标准中的滴定法无显著差异，可用于山楂药材和小儿麦枣咀嚼片中枸橼酸的含量测定。同时，HPLC法灵敏度高、分析速度快、抗干扰强，更适用于中成药及基质复杂样品中枸橼酸含量的测定。