UPE-HILIC-DAD-ESI-TOF/MS法测定山东产区丹参中丹酚酸类成分

东莎莎，程素盼，马天宇，刘伟，张渝洁，王晓，刘代成，赵恒强*

(1.齐鲁工业大学(山东省科学院)，山东省分析测试中心，山东省中药质量控制技术重点实验室，山东 济南 250014；2.中华全国供销合作总社济南果品研究院，山东 济南 250014； 3.临沂大学生命科学学院，山东 临沂 276005; 4.山东师范大学生命科学学院，山东 济南 250014)

丹参系唇形科鼠尾草属植物丹参SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根及根茎，始载于《神农本草经》，具有活血祛瘀、通经止痛、清心除烦、凉血消痈之功效[1-3]。现代医学研究表明，丹参中丹酚酸类成分有明显的抑制血小板聚集、抗凝血及降低血脂、抗动脉粥样硬化的作用，能缩小心肌梗死的范围，减轻病情，具有较大的临床药用价值，广泛用于临床各种心血管疾病的治疗[4-5]。2015版《中国药典》将丹酚酸类的丹酚酸B作为质控指标[1]。中药具有多成分、多靶点的特点，单一的指标成分不能全面反映中药的质量。因此，丹参中丹酚酸类、多成分的同时分析测定是提升丹参药材质量评价标准的必然要求。

目前，丹参中丹酚酸类成分主要采用超声和水浴回流法提取[1,6-7]，用反相色谱法进行分析。超声提取法在提取过程中由于其热效应会造成提取溶剂温度升高，水浴回流提取本身采用溶剂加热、蒸发、冷凝回流方式提取，而丹参酚酸类成分本身是热不稳定成分，两种提取方式不可避免会造成目标物一定程度的分解，影响最终测定结果准确性。另外，丹参中丹酚酸类成分在反相色谱柱上保留较差，为提高保留效果，一般采用高比例水相进行洗脱，然而高比例水相会影响色谱柱使用寿命，同时与质谱的兼容性较差。因此，发展探究丹参中丹酚酸类、多成分的准确、高效提取和对色谱、质谱兼容性好的分析方法具有重要意义。

超高压(ultrahigh pressure extraction, UPE)提取技术是近年来新发展的一种高效提取技术，利用100 MPa以上的流体静压力作用于溶剂和中药的混合液，保压一段时间后卸压，因其内外压差骤变使细胞破裂，有效成分释放出来，从而达到提取的目的。该方法与超声波辅助提取法和水浴回流提取法相比有提取率高、提取时间短、能耗低、纯度高[8-10]等优点，并且避免了因热效应引起的有效成分结构变化、损失以及生理活性的降低。目前，该技术在天然化学成分提取中的应用越来越广泛，已成功提取了黄酮、皂苷、生物碱、茶多酚等多种中药化学成分[11]。亲水色谱(HILIC)是一种新型色谱分离技术，其采用强极性材料作为固定相，对极性和水溶性成分保留较好；以高比例的乙腈作为有机相，与质谱兼容性较好；与电喷雾飞行时间质谱(ESI-TOF/MS)联用可以实现对极性成分的良好分离和鉴别。目前，该技术在天然产物极性成分分析中表现出良好的应用前景[12-16]。

本研究建立了UPE-HILIC-DAD-ESI-TOF/MS提取和分析测定丹参中丹酚酸类成分的方法，并用于山东产区丹参药材中丹酚酸类成分的测定，研究结果将为丹参中丹酚酸类多成分的高效提取和分析测定提供技术支持。

1 实验仪器与材料

1.1 仪器与试剂

1260型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)，配有二极管阵列(DAD)检测器，四元泵，柱温箱，自动进样器等；Agilent 6520 Q-TOF液质联用仪(美国Agilent公司)；HPP·L3-600型超高压生物提取设备(天津市华泰森淼有限公司)；KQ-400KDE型高功率数控超声波仪(昆山市超声仪器有限公司)；Milli-Q(18.2 MΩ)超纯水处理系统(美国Millipore公司)；THZ-8恒温水浴锅(中国浙江嘉兴电热仪器厂)。

XBridge Amide色谱柱(4.6 mm×250 mm,3.5 μm，美国Waters)；Merck SeQuant ZIC-HILIC色谱柱(2.1 mm×150 mm,3.5 μm,德国Merck) ；XBridge HILIC色谱柱(2.1 mm×150 mm, 3.5 μm，美国Waters)。

甲醇、乙腈(色谱纯，美国Fisher Scientific)；甲酸、乙酸铵、甲酸铵(色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)；其余试剂均为分析纯，水为自制Milli-Q超纯水。

1.2 样品的收集与处理

本研究所采用的丹参样品均采自济南各大药店以及不同种植基地，采集时间为2011年至2012年，采集12个不同批次的样品，经山东省分析测试中心王晓研究员鉴定为正品丹参SalviamiltiorrhizaeBge.，所采集到的样品详细信息见表1。丹参样品置于烘箱中55 ℃鼓风干燥4 h。干燥后粉碎，过40目筛子，混合均匀，制备成丹参干粉样品，密闭、避光、干燥、常温贮藏。

表1 丹参药材来源

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备

2.1.1 超高压提取法

a 提取溶剂 b 料液比 c 提取时间

2.1.2 超声波辅助提取法

2.1.3 水浴回流提取法

不同提取方式下的色谱图见图2。

图2 不同提取方式下的色谱图Fig.2 Chromatograms of samples prepared using different extraction methods

2.2 标准溶液的配制

分别精密称取丹酚酸A、迷迭香酸、原儿茶醛、原儿茶酸、熊果酸、紫草酸、丹酚酸B对照品各1.0 mg，置于1 mL量瓶中，用去离子水定容至刻度线，配制成质量浓度为1.0 mg/mL的对照品储备溶液，保存备用。精密吸取各对照品储备液适量于1 mL容量瓶中，加去离子水定容至刻度，配成含丹酚酸B 50 μg/mL，含其余标准品40 μg/mL的标准混合对照品溶液，保存备用。

2.3 色谱条件

XBridge Amide色谱柱(4.6 mm×250 mm，3.5 μm)，流动相A：0.8%甲酸、20 mmol/L甲酸铵、30%乙腈、10%正丁醇的水溶液，流动相B：乙腈(含0.8%甲酸)，流速为0.8 mL/min，柱温25 ℃，检测波长280 nm，进样量20 μL，洗脱程序为T：0-5-12-17-23-27-35-40-43-50-55-57-60-62 min，B%：94%-94%-92%-90%-89%-88%-87%-86%- 86%-85%-60%-50%-45%-20%。优化后的色谱图见图3。

图3 丹参HILIC-DAD(280 nm)色谱图Fig.3 HILIC-DAD (280 nm) chromatogram of Danshen

2.4 质谱条件

ESI-MS工作条件如下：负离子电离模式，雾化气压力45 psi，干燥气(N2)流速10.0 L/min，干燥气体温度340 ℃，毛细管电压4300 V，裂解电压100 V，锥孔电压60 V，全扫描(Scan)质荷比(m/z)为50～1000。样品的总离子流图见图4，质谱鉴别结果见表2。

图4 丹参HILIC-ESI-TOF/MS 总离子流Fig.4 TIC chromatogram of HILIC-ESI-TOF/MS of Danshen

表2 丹参提取物中7个化合物的HILIC-ESI-TOF/MS测定结果

2.5 方法学考察

2.5.1 标准曲线及检测限

按2.3节色谱条件进样分析，测定各不同浓度的混合标准液中各化合物的峰面积，以各化合物浓度(μg/mL)为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，并求得回归方程。将标准溶液稀释至低浓度进样，以3倍信噪比计算各丹酚酸类成分的检测限，以10倍信噪比计算定量限，结果见表3。

表3 7种酚酸HILIC分析回归方程、线性范围等结果

2.5.2 精密度

按2.3节色谱条件，对同一供试品溶液重复进样6次测定，分别测得7个色谱峰的峰面积和保留时间，分别计算其相对标准偏差。7个色谱峰峰面积和保留时间相对标准偏差为0.26%～3.79%和0.31%～2.25%，表明仪器精密度良好。

2.5.3 重复性

精密称取同一丹参样品6份，按2.1供试品溶液制备方法进行处理，按照2.3节色谱工作条件进样分析，测得7个色谱峰的峰面积和保留时间，并计算其相对标准偏差，7个色谱峰峰面积和保留时间的相对标准偏差分别为1.59%～4.43% 和1.31%～2.21%，表明该方法重复性良好。

2.5.4 稳定性

将供试品溶液按照2.3节色谱工作条件，分别在0、1、3、6、12、24 h进样测定，结果显示，7个色谱峰峰面积和保留时间的相对标准偏差分别为1.48%～3.25%和0.72%～2.48%，说明供试品溶液在24 h内化学性质稳定。

2.5.5 加标回收率

精密称取已知各目标化合物含量的丹参样品0.50 g，分别准确加入丹酚酸A、迷迭香酸、原儿茶醛、原儿茶酸、熊果酸、紫草酸、丹酚酸B对照品适量，按照供试品溶液制备方法处理6 份，按上述色谱条件进样分析，测定各目标化合物峰面积，计算平均加样回收率(n= 6)分别为92.1%、95.7%、98.7%、102.7%、99.2%、95.8%、94.7%，相对标准偏差分别为3.43%、2.79%、4.17%、3.36%、3.18%、2.53%及3.57%。

2.6 样品测定

采用2.1节供试品溶液制备方法制备样品溶液，采用2.3节色谱条件分别进样分析，获得12批丹参样品中7种丹酚酸类化合物色谱峰面积，将测得结果带入表3的线性回归方程，计算丹参样品中各丹酚酸类化合物的含量(表4)。

表4 丹参中7种丹酚酸类化合物含量测定结果(n=3)

续表4

从表4 可以看出，12批山东产区丹参样品中7种丹酚酸类成分含量以丹酚酸B含量最高，其平均值达到(38.725±5.464)mg/g；原儿茶醛的含量最低，其平均值达到(0.124±0.011)mg/g；7种丹酚酸类成分总含量为(45.714±5.537)mg/g。7种丹酚酸类成分含量由大到小依次为丹酚酸B、紫草酸、迷迭香酸、原儿茶酸、丹酚酸A、熊果酸、原儿茶醛。

3 讨论

3.1 提取条件优化

本研究采用单因素试验对超高压提取条件进行了优化。考察了不同提取溶剂(水、20%甲醇、40%甲醇)对丹参水提物的提取效果(图1a)，结果表明，用20%甲醇作提取溶剂时，丹参水提取物中4个代表性色谱峰(峰1、2、3、7)的相对峰面积(以水提物中4个代表色谱峰的相对峰面积作为1)整体较高，且色谱峰较多、各峰分离度好、基线平稳，因此选择20%甲醇作为丹参中丹酚酸类成分的提取溶剂。

在优化的超高压提取条件下，进一步对超高压提取法、超声波辅助提取法和水浴回流提取法进行了比较，如图2所示。结果表明，采用超高压提取法，丹参中丹酚酸类成分提取率明显优于超声波辅助提取法和水浴回流提取法。

3.2 色谱条件优化

不同的亲水柱材料对亲水性化合物分离效果存在明显差别。本研究对1.1节中所列的3 根不同类型的色谱柱(XBridge Amide色谱柱(4.6 mm×250 mm，3.5 μm，美国Waters)、Merck SeQuant ZIC-HILIC色谱柱(2.1 mm×150 mm，3.5 μm，德国Merck)、XBridge HILIC色谱柱(2.1 mm×150 mm，3.5 μm，美国Waters)进行了比较，结果表明，使用Waters XBridge Amide色谱柱获得的丹参甲醇水提取物各色谱峰分离度高、分布均匀、峰对称性较好。因此，选择Waters XBridge Amide柱用于丹参甲醇水提取物的分析。

水和乙腈常被选作亲水色谱的流动相，丹参中丹酚酸类成分复杂、数量较多，本研究采用乙腈-水作为流动相、采用梯度洗脱法用于其分离研究。由于酚酸类成分含有羧基，容易与色谱柱填料发生作用造成拖尾现象，加入一定量的有机弱酸会明显抑制羧酸的电离，避免拖尾现象的发生。另外，流动相中加入一定量的挥发性盐，有助于改善色谱峰峰型，同时避免或减少对质谱离子化的影响。考察了水相和有机相中分别加入不同含量甲酸挥发性盐的影响，结果表明，当选择H2O(0.8%甲酸、20 mmol/L甲酸铵)+乙腈(0.8%甲酸)作流动相时，各色谱峰分离良好，峰型尖锐。

由于乙腈-水体系对亲水色谱柱上各丹酚酸类化合物洗脱能力较强，造成分离效果差。考察了水相中添加不同比例乙腈、正丁醇的分离效果，结果表明，采用0.8%甲酸+20 mmol/L甲酸铵+30%乙腈+10%正丁醇作为流动相A时，丹参水提物中各化合物具有较好的保留和分离效果。