电针调控大鼠脊髓损伤后灰质中BDNF、NGF和NT3的表达

朱斌，关炳瑜，贺元，阿海，王晓锋

(西宁市第一人民医院，西宁 810000)

脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)是临床较常见的由创伤引起的严重神经损伤疾病，常引起患者出现于损伤平面以下肢体运动功能障碍和感觉功能障碍，严重影响患者的生活质量和活动能力[1-2]。但目前仍未有对SCI有显著效果的治疗方法[3]。神经生长因子(nerve growth factor，NGF)是神经营养因子家族的成员之一，对神经具有重要的营养作用和促进其生长作用。研究表明[4]，内源性NGF在SCI后修复中有关键作用，其高表达可促进损伤神经的修复和神经功能恢复。脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)也是神经营养因子家族的成员之一，目前认为其对神经元再生和分化以及神经内环境稳定均有不可替代的作用[5-6]。神经营养因子3(neurotrophin 3，NT3)作为神经营养因子家族的重要一员，可以干预SCI后神经修复抑制因子作用的信号传导过程，促进中枢神经的再生，对SCI后的修复有重要作用。

电针是中医药领域中的重要治疗方法之一，临床广泛应用于治疗SCI，对SCI引起的运动功能障碍、感觉功能障碍以及尿潴留等并发症具有良好的治疗效果[7]。研究发现[8-10]，电针对中枢神经系统具有一定的保护作用，能促进受损神经修复。为进一步探讨电针对SCI后神经系统修复和肢体功能恢复的影响，本实验观察电针对SCI后BDNF、NGF和NT3表达的调控作用，进一步明确电针治疗SCI的相关作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

选用36只SPF级SD大鼠，雌雄各半，年龄10～12周，体质量为(250±30)g，许可证号码SCXK(沪)2017-003。在动物实验中心适应性饲养1周后开始进行实验。将36只SD大鼠随机分为为假手术组、模型组和电针组，每组12只。

1.2 主要仪器及试剂

试剂包括兔抗NGF抗体(abcam，美国，批号ab6199)、兔抗BDNF抗体(abcam，美国，批号ab108319)、羊抗NT3(abcam，美国，批号ab7484)、抗体Alexa Fluor 488荧光二抗(赛默飞，美国，批号A-27012)、568荧光二抗(赛默飞，美国，批号A-11004)、山羊抗兔IgG H&L(HRP)抗体(abcam，美国，批号ab6721)、驴抗山羊IgG H&L(HRP)抗体(abcam，美国，批号ab6885)、尼氏染色液(索莱宝，北京，批号G1430)，AceQ实时定量PCR SYBR Green Master Mix试剂盒(Q111-02/03，维诺赞)、HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for实时定量PCR(+gDNA wiper)试剂盒(R223-01，维诺赞)；仪器包括NYU脊髓打击器(W.M.Keck神经科学协作中心，美国)；0.30 mm×13 mm毫针(华佗牌，苏州医疗用品厂有限公司)；医用电针治疗仪(G6805，苏州医疗用品厂有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 SCI模型制备

采用7%水合氯醛对大鼠进行腹腔注射麻醉，注射剂量为5 mL/kg。麻醉成功后，选择T9-T11区域备皮，暴露手术部位，消毒；沿大鼠后正中线作一长约2～3 cm纵行切口，分别切开皮肤、肌肉、筋膜等软组织，使用小型咬骨钳咬除椎板，暴露脊髓；固定大鼠躯体，调整打击杆，瞄准T9-T11节段脊髓，使10 g的打击杆自12.5 mm高度落下打击脊髓，出现大鼠后肢回缩扑动及尾部快速摆动提示造模成功；0.9%氯化钠溶液冲洗伤口，逐层缝合。术后所有大鼠单笼饲养，以木屑保暖，每日2次人工按摩膀胱助其排尿排便。术后每日大鼠前肢肌肉注射青霉素4万单位，预防感染。模型组和电针组大鼠均成功制备SCI模型，无死亡。

1.3.2 干预方法

手术后第1天开始进行干预。电针组取穴为双侧肝俞、脾俞穴[11]。具体定位参考《实验针灸学》[12]中的定位方法。将毫针斜刺入上述穴位2 mm。设置电针仪的电流强度为1～3 mA，频率为2 Hz，选连续波，以使大鼠背部肌肉产生轻微抽动，同时使瘫痪的下肢肌肉出现规律性收缩。每日治疗1次，每次20 min，干预1周后动物处死。假手术组和模型组每日同一时间同等条件抓取20 min后回笼饲养，不予任何治疗。

1.3.3 行为学评分

手术后每日对所有大鼠进行行为学评分实验。根据大鼠脊髓损伤行为学评分(Basso Beattie Bresnahan，BBB)进行评分，判断SCI后大鼠的肢体运动功能障碍情况。本评分全程由2名熟悉BBB评分操作和评分但未知晓实验目的的实验人员完成，最终分值取2名实验人员的平均分。

1.3.4 取材

大鼠麻醉后，每组分别随机选取6只大鼠采用4%多聚甲醛灌注固定取材，取T9-T11节段脊髓组织并放入4%多聚甲醛溶液中固定48 h，用于尼氏染色和免疫组化检测；剩余6只大鼠采用直接取材，取T9-T11节段长约2 cm的脊髓组织，于-80℃保存，用于Western Blot检测和实时定量PCR检测。

1.3.5 尼氏染色

将5 μm石蜡组织切片脱蜡至入水，使用尼氏染色液在60℃下染色50 min，PBS溶液漂洗，分色液分色2 min，晾干，中性树胶封片，镜下观察脊髓灰质前角区域并拍片。

1.3.6 免疫荧光检测

石蜡组织切片脱蜡至水，修复，冷却；经PBS洗涤后，用0.3% Triton X-100溶液浸泡10 min；血清室温封闭1 h，甩掉封闭液不洗；分别滴加NGF一抗(1：200)、BDNF一抗(1：200)和NT3一抗(1：200)，4℃过夜；次日先将切片复温0.5 h，PBS洗涤后在避光环境下加Alexa Fluor 488或568荧光二抗，37℃烤箱孵育1 h；PBS洗涤，使用抗荧光减退封片剂封片，在荧光显微镜下观察脊髓灰质前角区域，采用Image J软件识别视野中免疫荧光阳性细胞并标记计数，每只大鼠随机取6张标本进行观察，每张标本随机取6个视野进行计数，计算平均数为每只大鼠脊髓灰质前角区域的免疫荧光阳性细胞数。

1.3.7 Western Blot检测

将脊髓组织研磨呈糜状后加入裂解液，冰浴60 min。14000 rp离心10 min，BCA法定量蛋白。计算蛋白浓度。使用SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，观察Marker蛋白的位置。转膜，封闭，漂洗3次。先后加入NGF一抗(1：1000)、BDNF一抗(1：1000)、NT3一抗(1：1000)和山羊抗兔二抗(1：1000)或驴抗山羊二抗(1：1000)。漂洗后去除二抗后使用化学发光试剂显影。在避光条件下显影，凝胶扫描成像系统进行分析。

1.3.8 实时定量PCR

首先提取总RNA，然后将总RNA逆转录为cDNA，反应体系为20 μL。反应条件为51℃反应2 min，96℃预变性10 min，96℃变性10 s，退火60℃反应30 s，40个循环。先算出△Ct值，再计算△△Ct，目的基因的表达差异为2-△△Ct。引物序列详见表1。

表1 引物序列表

1.3.9 统计学方法

采用SPSS22.0软件进行统计分析。BBB肢体功能评分属于多组多时间点的数据，采用重复测量资料的分析，同时不符合正态分布，采用非参数检验；对于符合正态分布的结果采用单因素方差分析，数据用均数±标准差表示。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠不同干预时间BBB评分比较

重复测量资料检测分析显示，各组数据之间不符合Mauchly球形检验(P=0.000)，经过校正结果后发现，时间效应显示不同时间点的各组大鼠BBB肢体运动功能评分具有差异性(P＜0.05)；采用非参数检验发现，与假手术组比较，模型组和电针组术后BBB评分显著下降，差异具有统计学意义(P＜0.05)；与模型组比较，电针组自术后第5天的BBB评分显著增高，差异具有统计学意义(P＜0.05)。详见图1。

图1 各组大鼠不同干预时间BBB评分比较

2.2 尼氏染色观察各组神经元形态

如图2所示，假手术组神经元形态规则，结构完整，可见丰富的紫褐色尼氏体，细胞核大，核仁明显；模型组尼氏体碎裂、形态细小，数量较少，部分神经元周围可见明显的液化空洞；电针组神经元形态较模型组改善，尼氏体形态较饱满，数量较多。

2.3 免疫荧光法检测脊髓中BDNF、NGF和NT3阳性表达

如图3所示，NGF阳性细胞呈红色，BDNF阳性细胞呈红色，NT3阳性细胞呈绿色，假手术组BDNF、NGF和NT3阳性细胞亮度较暗，数量较少；模型组和电针组BDNF、NGF和NT3阳性细胞亮度较高，数量较多。

如图4所示，与假手术组相比，模型组和电针组BDNF、NGF和NT3阳性细胞数显著增多，差异有统计学意义(P＜0.05)；与模型组相比，电针组BDNF、NGF和NT3阳性细胞数显著增多，差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.4 Western Bolt检测BDNF蛋白、NGF蛋白和NT3蛋白表达情况

如图5所示，假手术组的BDNF蛋白、NGF蛋白和NT3蛋白表达量较少，模型组和电针组BDNF蛋白、NGF蛋白和NT3蛋白表达量较多。

如图6所示，与假手术组比较，模型组和电针组BDNF蛋白、NGF蛋白和NT3蛋白表达量显著增加，差异具有统计学意义(P＜0.05)；与模型组比较，电针组BDNF蛋白、NGF蛋白和NT3蛋白表达量显著增加，差异具有统计学意义(P＜0.05)。

2.5 实时定量PCR检测BDNF mRNA、NGF mRNA和NT3 mRNA表达情况

如图7所示，与假手术组比较，模型组和电针组BDNF mRNA、NGF mRNA和NT3 mRNA表达量显著增加，差异具有统计学意义(P＜0.05)；与模型组比较，电针组BDNF mRNA、NGF mRNA和NT3 mRNA表达量显著增加，差异具有统计学意义(P＜0.05)。

图2 尼氏染色观察神经元形态(×200)

图3 免疫荧光检测BDNF、NGF和NT-3表达(×200)

图4 BDNF、NGF和NT-3阳性细胞数

图5 Western Blot检测BDNF、NGF和NT3蛋白表达

图6 各组蛋白相对表达量

图7 各组mRNA相对表达量

3 讨论

脊髓损伤是临床常见的神经系统损伤疾病，但是目前尚未有理想的治疗方法[13]。SCI的损伤程度及治疗时间对患者的预后极为重要，特别是早期及时治疗更应予以重视[14-15]。脊髓内部及外部的微环境在SCI发生后发生了较大的变化，产生众多复杂的病理反应[16-17]。这些病理反应严重阻碍了SCI后神经系统的修复。因此，促进受损神经元及轴突修复，重建神经通路连接被认为是治疗SCI的重要思路，以有利于SCI患者丧失的神经功能得到部分的恢复[18]。

NGF是神经营养因子家族重要成员，在神经系统损伤后的修复过程中扮演重要角色，可发挥营养损伤的神经和轴突，促进损伤的神经和轴突的修复和再生的作用[19]。研究表明[20]，胶质细胞以及脊髓腹侧角运动神经元和外周神经元中含有丰富的NGF。SCI发生后，神经系统中的上述细胞内的NGF收到靶细胞基因调控信号后开始表达并释放到细胞，发挥促进损伤修复的作用[21]。除NGF以外，BDNF也是神经营养因子家族的重要成员，对神经元也有促生长和促修复的重要作用[22]。神经系统损伤后，BDNF可促进损伤神经元修复、再生以及有利于神经环路重建，促进神经系统修复。此外，NT3作为神经营养因子家族的成员，在神经系统内广泛存在，具有调控神经发育和再生的重要作用。研究表明，一方面，NT3与其受体TrkC结合可发挥诱导神经前体细胞朝着神经元的方向分化，同时诱导骨髓间充质干细胞朝着功能性神经元的方向分化，从而有利于神经元的再生[23]；另一方面，NT3具有调控Bax/Bcl-2表达的作用，可抑制Bax表达，促进Bcl-2表达，对SCI后神经元凋亡有抑制作用，从而在SCI后发挥保护作用[24]。多项动物实验证实[25-27]，多种治疗手段可通过调控神经营养因子的表达水平而有利于SCI后神经元和轴突的修复和再生，改善SCI大鼠神经功能和运动功能，降低并发症。本研究结果发现，SCI发生后，大鼠SCI处的神经营养因子包括BDNF、NT3和NGF均出现表达增多的现象。这说明在SCI发生后，损伤组织、细胞发出损伤信号促进BDNF、NT3和NGF的表达以促进损伤神经元和神经系统的修复。但是，由于SCI造成众多神经元死亡，势必影响营养因子及其受体表达的增加，使其对神经系统的修复作用和保护作用受到限制，单靠SCI后内源性神经营养因子的自身表达很难发挥良好的作用。因此，如何有效调控SCI后神经营养因子的表达水平是治疗SCI的新思路。

SCI多由于跌仆损伤或外伤暴力导致脊髓受损，气滞血瘀，气血运行不畅，从而出现肌肉痿软无力，筋脉萎缩失养，运动不利，二便失司等症状。中医学基础理论认为，肝主筋，脾主肉，两者与肢体运动关系密切，肝脾气血充足，则筋脉肌肉得其所养，筋脉肌肉强健有力，运动灵活。肝俞穴和脾俞穴为膀胱经的背俞穴，与肝脾关系密切，刺激肝俞穴和脾俞穴有利于调节肝脏和脾脏的功能并通调水道。因此，临床常选取肝俞穴和脾俞穴用于治疗SCI、筋脉肌肉痿软无力等病症。

本实验结果显示，电针干预7 d后，SCI模型大鼠的BBB肢体运动功能评分显著提升，说明电针治疗促进了SCI后肢体运动功能在一定程度的恢复。尼氏染色结果提示电针组的大鼠脊髓神经元形态优于模型组，说明电针干预有利于SCI模型大鼠神经元的修复，这也可能是电针促进SCI模型大鼠肢体运动功能恢复的原因之一。同时，本研究结果发现电针干预可显著促进SCI后BDNF、NGF和NT3表达。鉴于BDNF、NGF和NT3对神经系统损伤后神经修复方面的重要作用，本研究认为，电针通过上调SCI后NGF和BDNF表达，从而有利于神经元修复和再生，促进大鼠肢体运动功能的恢复。但是，电针调控SCI后BDNF、NGF和NT3表达深入作用机制仍需后期进一步研究。