利用气相色谱法分析不同萃取方法对鱼油中EPA、DHA含量的影响

赵霞 闫善信 瓦房店市疾病预防控制中心 （辽宁 大连 116300）

内容提要： 目的：查究气相色谱法分析不同萃取方法对鱼油中EPA、DHA含量的影响。方法：利用超声强化亚临界水、酶解法、超临界CO2萃取、超声辅助溶剂等方法从黄鲛鱼胃部萃取鱼油，并利用气相色谱法进行分析，以比较四种萃取方法萃取的鱼油中的EPA、DHA含量。结果：不同萃取方法严重影响鱼油中EPA与DHA的含量，且各萃取方法中EPA与DHA的含量的差异性极为明显，在统计学方面存在意义（P＜0.01）。结论：不同的萃取方法会对鱼油中的EPA、DHA含量产生较大影响。

鱼油中存在丰富的饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸，以脂肪酸二十碳五烯酸（EPA）与二十二碳六烯酸（DHA）为主要成分[1]，有“脑黄金”的誉名。

1.材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料。选择黄鲛鱼鱼胃；分析纯则选择天津科密欧化学试剂有限公司提供的异辛烷、氢氧化钾、硫酸氢钠、甲醇、无水硫酸钠；Sigma公司提供的纯度超过99%的EPA甲酯与DHA甲酯标准品。

1.1.2 仪器。岛津国际贸易有限公司提供的型号为Rtx-5的气相色谱柱、色谱仪（30m×25mm）；杭州华黎泵业有限公司提供的型号为HA220-50-06的超临界CO2萃取设备；常熟市天量仪器有限责任公司生产的型号为LT3002E的电子天平；上海亚荣生化仪器厂生产的型号为SHZ-Ⅲ循环水真空泵与型号为RE-52的旋转蒸发器；型号为PS-10A的洁康牌超声波；上海惊宏实验设备有限公司生产的型号为DHG-9076A的电热恒温鼓风干燥箱；而超声强化亚临界水设备则是由实验室自制的。

1.2 实验方法

1.2.1 鱼油提炼。清洗黄鲛鱼鱼胃，清除杂质，并从中提炼鱼油，将黄鲛鱼鱼胃切割成尺寸1cm大小的原料样品，将其放置在-60°C的冷阱环境中，针孔压力设置为0.1Pa，在冷冻干燥24h后，将样品放置在密封盒中以冷藏备用。通过超声波辅助溶剂、超临界CO2法、超声强化亚临界水、中性蛋白酶水解等多种方法从黄鲛鱼鱼胃中提炼黄油，严格按照相关规定的标准要求进行操作，严格掌控鱼油的萃取时间与萃取温度，各仪器设备的萃取参数如下：超声波辅助溶剂：500W、20kHz、25°C、30min（正乙烷提取）；超临界CO2萃取设备：65°C、30MPa、5h、设置3mL/min的流体速度；超声强化亚临界水设备：250W、20kHz、5022kPa、60min；酶解：选用中性蛋白酶，剂量为1%（W/W），30°C振荡5h进行提取。

1.2.2 脂肪酸甲酯提炼。严格按照GB/T173-76-2008的国标提炼脂肪酸甲酯。

1.2.3 分析条件。选用型号为Rtx-5的色谱柱，30m×0.25mm，FID检测器的温度设置为320°C，进样器的温度设置为300°C，空气流量控制在300mL/min左右，而燃烧气（氢气）的流量控制在30mL/min左右，进样量设置是1μL，其载气为氮气。调整升温程序中的分流比与温度等相关参数，以求能够准确测量样品中的EPA与DHA含量。

1.2.4 计算目标峰以及与其相邻峰的分离度。分离度又名为分辨率，是指目标峰和与它相邻峰之间的分离程度，通常表示为R。R值越高，就说明相邻的两峰间的分离程度越好。在R不超过1时，表示相邻的两峰之间存在重叠情况；在R等于1时，表示相邻的两峰之间已基本完成分离；在R等于1.5时，表示相邻的两峰之间不存在任何联系，已分离彻底。R值是指相邻两色谱峰之间的保留时间差/相邻两色谱峰的峰宽均值，利用公式可表示如下：

公式（1）中的符号代表意义如下：tR1是指相邻两峰的前峰所对应的保留时间；tR2是指相邻两峰的后峰所对应的保留时间；W1、W2指的是相邻两峰之间存在的峰宽。

1.2.5 萃取方法的不同影响的EPA与DHA含量。EPA与DHA通过异辛烷进行稀释，以用于GC分析，对分离最大值时的升温程序进行分析，以色谱分析结果为基础，明确EPA与DHA保留时间，并根据样品中的EPA与DHA浓度和色谱峰面积得出标准方程，公式如下：

公式（2）中的C是指鱼油样品中的EPA与DHA浓度；V溶剂是指溶剂体积；C0是指标准的EPA与DHA浓度；Ax是指EPA与DHA的色谱峰面积；A0是指标准的EPA与DHA色色谱峰面积；Mx是指样品质量。

1.2.6 统计学分析。数据资料均输入Excel中分析误差，并通过邓肯多比较法分析显著性差异。

2.结果

2.1 本次探究活动中所涉及到的数据资料均为平均值

在Excel进行数据方差分析过程中，均得出P值、F值等数据，由此可知：不同萃取方法严重影响鱼油中EPA与DHA的含量，且各萃取方法中EPA与DHA的含量的差异性极为明显，在统计学方面存在意义（P＜0.01）。详情见表1。

从表1与图1中可以看出：在鱼油提炼中，超声强化亚临界水的效率最高，为13.97%，尤其是EPA与DHA的萃取率远高于其他萃取方法，分别是54.67mg/g与134.01mg/g。

表1. 萃取方法的不同对鱼油萃取率、EPA与DHA含量的影响

3.讨论

本次脂肪酸甲酯化使用国标GB/T173-76-2008，能够有效保证甲酯化的程度，保证鱼油样品中EPA与DHA的含量测定的准确性，从而保证各萃取方法中EPA与DHA的含量测定的精确性[2]。

本研究中，超声强化亚临界水的鱼油萃取率较高，相应的其EPA与DHA的含量也是最高的，其次是酶解法，最后是超临界CO2萃取法与超声辅助溶剂方法，差异性显著，在统计学方面有意义（P＜0.01）。和现有的张郢峰等人的研究结果差异不大。

综上所述，我国市场中所售卖的鱼油商品均是经过甲酯化处理的，因此甲酯化后测定鱼油中的EPA与DHA的含量的结果精确度更高，且EPA与DHA的含量受到鱼油萃取方法的影响。

图1. 各萃取方法的鱼油萃取气相色谱图