杜马斯燃烧法和凯氏定氮法在稻米蛋白质检测中的对比研究

2019-10-18秦琳黄世群仲伶俐付成平周虹赵珊向冰雷绍荣

中国稻米 2019年5期

秦琳黄世群仲伶俐付成平周虹赵珊向冰雷绍荣

（四川省农业科学院分析测试中心，成都610066；第一作者：QinlinL＠126.com；*通讯作者：leishaorong2004＠163.com）

稻米是我国的传统主食，其主要成分是淀粉和蛋白质，在含水量为14%的稻米中，淀粉和蛋白质含量分别为76.7%～78.4%和6.3%～7.8%[1-2]。稻米蛋白质是优质的植物蛋白，必需氨基酸种类丰富，其生物价值、蛋白质利用率等均高于小麦蛋白和玉米蛋白，是决定稻米营养品质的主要指标[3-8]。目前，稻米蛋白质含量的测定方法主要为凯氏定氮法和杜马斯燃烧法，其中，凯氏定氮法是检测蛋白质含量的标准检验方法，其准确度高、重现性好。但采用凯氏定氮法时，需要大量化学试剂（如浓硫酸、氢氧化钠溶液和硼酸溶液等），不仅加大了检测成本，且严重污染环境，对实验员健康存在潜在危害[9-10]。相比之下，杜马斯燃烧法具有环保和高效的优势，已被欧美、日本等发达国家在多个行业采用[11-12]。近几年来，在我国也逐渐被应用到如谷类、豆类粗蛋白质含量的测定中（NY/T 2007-2011[13]）。其测定原理是试样在纯氧（≥99.99%）环境中高温燃烧，燃烧过程中产生混合气体，其中的碳、硫等干扰气体和盐类被吸收管吸收，氮氧化物被全部还原成氮气，形成的氮气气流通过热导检测器（TCD）进行检测[14]，再乘以相应的转换系数得到蛋白质含量。

近几年来，国内关于杜马斯燃烧法测定饲料粗蛋白[10，15]、油料粗蛋白[16]、土壤全氮[17-18]和食品（奶粉、牛奶、黄豆、肉类、人参等）中蛋白质含量[9，19-21]的研究较多，结果表明杜马斯燃烧法可以作为测定饲料、油料和食品中蛋白质含量的常规检测方法；但用于测定土壤全氮时，含氮量较低的土壤样品测定结果准确度要低于凯氏定氮法[18]。杜马斯燃烧法用于稻米蛋白质的检测报道较少，为此，本试验采用杜马斯燃烧法和凯氏定氮法同时对40个精米和10个糙米样品的蛋白质含量进行检测，通过对两种方法测定结果的精密度、准确度和相关性及检测成本进行比较分析，探讨杜马斯燃烧法用于稻米蛋白质检测的可行性，以期为准确、高效测定稻米蛋白质含量提供方法参考和理论依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

40个精米和10个糙米样品由农业农村部食品质量监督检验测试中心（成都）提供，为2018年不同水稻主产区生产的水稻产品。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 仪器

rapid MAX N EXCEED型元素分析仪，德国Elementar公司生产；FOSS2400全自动凯氏定氮仪、消化炉，瑞典FOSS公司生产；AUY 220电子天平，日本岛津公司生产，精度为0.1 mg。

1.2.2 试剂与气体

浓硫酸；催化剂（K2SO4∶CuSO4·5H2O=10∶1）；10 g/L硼酸溶液；400 g/L氢氧化钠溶液；0.05 mol/L盐酸标准滴定溶液，按照GB/T 601-2016《化学试剂标准滴定溶液的制备》规定配制并标定；0.1%甲基红乙醇溶液；0.1%溴甲酚绿乙醇溶液；氧化铜和Pt催化剂；ESAREGAINER；氧化铝；五氧化二磷；氧气（纯度≥99.99%）；氦气（纯度≥99.99%）；标准品：硫酸铵，含 N 21.21%，纯度≥99.99%，天津市光复精细化工研究所生产；天冬氨酸，含 N 10.52%，纯度≥98%（HPLC），SIGMA公司生产。

1.3 测定方法

1.3.1 凯氏定氮法

称取待测样品约0.4 g（准确至0.0001 g）于消化管中，加入 5 g 催化剂（K2SO4∶CuSO4·5H2O=10∶1）和 10 mL浓硫酸，摇匀，在消化炉上420℃消化约1 h，待消煮液呈亮绿色并澄清透明后取下，冷却后缓慢加入约20 mL水。待液体冷却后，置于FOSS 2400全自动凯氏定氮仪上进行加碱蒸馏3.5 min，将试样中的氨通过冷凝由硼酸溶液直接吸收，并用盐酸标准溶液滴定硼酸吸收液，记录盐酸滴定体积，计算样品中蛋白质含量。每个样品重复测定3次，同时做5份空白测定。分别称取硫酸铵标准品 20.0、30.0、40.0、50.0 和 60.0 mg，进行蒸馏滴定，得标准曲线。

1.3.2 杜马斯燃烧法

采用rapid MAX N EXCEED型元素分析仪进行测定。称取待测样品约300 mg（精确至0.1 mg）于坩埚中，置于自动进样盘内，在燃烧炉温度达900℃以上、次级燃烧管温度达900℃以上、还原管温度达600℃以上、氧气（纯度≥99.99%）压力达0.25 MPa、氦气（纯度≥99.99%）压力达0.38 MPa，仪器自动进样检测，加氧时间为120 s，加氧流速为300 mL/min。每个样品做3次重复测定，同时做5份空白测定。分别称取天冬氨酸标准物质 50.0、100.0、150.0、200.0 和 250.0 mg，上机检测，得标准曲线。

1.4 数据处理

采用DPS统计软件对数据进行方差分析和多重比较，采用Excel软件进行线性回归分析。

2 结果与分析

2.1 杜马斯燃烧法与凯氏定氮法的精密度及质量控制比较

图1 凯氏定氮法含氮量标准曲线

图2 杜马斯燃烧法含氮量标准曲线

凯氏定氮法测定稻米蛋白质时，称取不同质量硫酸铵标准品，以称样量为横坐标、总氮含量为纵坐标建立标准曲线。总氮含量范围为4.11～12.5 mg，标准曲线为 y=0.2104 x-0.072，R2=0.9998（图 1）。采用杜马斯燃烧法时，称取天冬氨酸标准物质，以总氮含量为横坐标，峰面积为纵坐标建立标准曲线。总氮含量范围为5～25 mg，标准曲线为 y=2638.9 x+299.3，R2=1（图 2）。由此可见，两种方法测定标准品时，方法稳定，且回收率较高。

分别用凯氏定氮法和杜马斯燃烧法测定了全麦粉和糙米标准品的蛋白质含量、乙酰苯胺标准品的全氮含量，每个样品重复测定6次。从表1可看出，两种方法测定的全麦粉蛋白质含量和乙酰苯胺全氮含量结果相同，凯氏定氮法测定的糙米蛋白质含量与杜马斯燃烧法接近；两种方法测定的糙米蛋白质含量均低于标准品真实值，回收率分别为99.0%和99.2%。比较两种方法的RSD和RE值，可确定杜马斯燃烧法具有较高的精密度，且准确度良好。

表1 凯氏定氮法和杜马斯燃烧法测定3种标准品的全氮含量的结果（n=6）

2.2 杜马斯燃烧法与凯氏定氮法测定稻米蛋白质含量比较

用凯氏定氮法和杜马斯燃烧法测定了40个精米和10个糙米样品中的蛋白质含量。从表2可见，凯氏定氮法测定的40个精米样品的蛋白质含量范围为5.31%～7.39%，10个糙米样品的蛋白质含量范围为6.43%～7.83%，杜马斯燃烧法测定的40个精米样品和10个糙米样品的蛋白质含量范围分别为5.27%～7.35%和6.40%～7.89%；凯氏定氮法和杜马斯燃烧法测定的精米样品结果比值（K/D）为0.996～1.036，糙米样品为0.993～1.023。由此可见，两种方法对精米和糙米样品的检测表现出一致性。对两组数据进行单因素方差分析，可以看出两种方法测定结果有29个样品存在显著性差异，其中有28个样品的杜马斯燃烧法测定结果低于凯氏定氮法（偏低的范围为0.005%～0.035%），这表明采用杜马斯燃烧法测定稻米蛋白质含量其结果较凯氏定氮法偏低。这可能是其检测步骤与凯氏定氮法不同所致。首先杜马斯燃烧法是通过将试样在纯氧（≥99.99%）环境中高温彻底燃烧，再根据热导检测器检测产生氮气气流量来测得准确的氮含量，而凯氏定氮法检测氮含量需经标准酸溶液滴定量来算出，滴定终点以颜色判断，由于仪器灵敏度不同，可能会因酸滴定过量而使得检测值偏高；其次杜马斯燃烧法检测过程从进样到出结果是在完全密闭的系统中完成的，而凯氏定氮法的样品在称样后需经消煮、蒸馏和滴定，这3个过程不是在完全密闭和连续的体系中完成，可能存在NH3污染使得测定结果较凯氏定氮法稍高。

由图3和图4可看出，精米和糙米样品用凯氏定氮法测定结果的变异系数分别为0.02%～1.70%和0.20%～1.50%，杜马斯燃烧法测定结果的变异系数分别为0.01%～0.80%和0.01%～1.10%，两种检测方法变异系数均小于5%，稳定性都很高。但相比较而言，杜马斯燃烧法精密度和稳定性更优于凯氏定氮法。

2.3 两种方法的相关性分析

在对杜马斯燃烧法与凯氏定氮法测定稻米蛋白质含量进行比较的基础上，对两种方法测定结果的相关性进行分析。由图5和图6可见，两种方法测定精米蛋白质结果间均存在显著的线性相关（R2=0.9858），糙米测定值也存在显著的线性相关（R2=0.9788）。

2.4 两种方法的检测成本对比

检测成本是除精密度和准确度之外，评价一项检测方法可行性的重要指标。本试验中，两种方法的精米和糙米蛋白质测定次数为50×3=150，标准品测定次数为3×6=18；凯氏定氮法的硫酸铵测定次数为5，杜马斯燃烧法的冬氨酸测定次数为5；空白测定次数为5。

杜马斯燃烧法仅需称样就可上机检测，且试剂耗材不用配制；而凯氏定氮法检测前需要配制大量化学试剂，需要消煮样品，且消煮过程繁琐费时，蒸馏滴定时使用的酸碱对实验人员和环境都有较大危害。由表3可看出，完成本试验中所有样品的检测，杜马斯燃烧法仅需17.8 h，且1名实验员就可完成；而凯氏定氮法需39.3 h，2名实验员。由此可见，基于降低时间、人工成本和环保的角度来说，杜马斯燃烧法更具有优越性。

3 结论

杜马斯燃烧法和凯氏定氮法均能准确测定出稻米蛋白质含量，且精密度和准确度都符合要求。但相较于传统的凯氏定氮法，杜马斯燃烧法在稻米蛋白质检测中更具优势。对全麦粉标准品进行蛋白质检测时，杜马斯燃烧法的RSD为0.10%，精密度高于凯氏定氮法；对糙米标准品进行蛋白质检测时，杜马斯燃烧法的RE为0.8%，准确度优于凯氏定氮法；杜马斯燃烧法测定精米和糙米样品的变异系数分别为0.01%～0.80%和0.01%～1.10%，低于凯氏定氮法；两种方法测定精米蛋白质结果间均存在显著的线性相关（R2=0.9858），糙米测定值也存在显著的线性相关（R2=0.9788）。在检测成本方面，完成本试验中所有样品的检测，杜马斯燃烧法所需时间和人力都约是凯氏定氮法的1/2，上机检测前仅需称样，免去了消煮、配制试剂等诸多繁琐程序。在环境保护方面，杜马斯燃烧法不使用强酸强碱，少污染，对人体健康危害轻，是一种环保和高效的检测方法。但其能否完全代替凯氏定氮法还需要进一步研究。