MiR-132在大鼠肾间质纤维化模型中的表达及意义

谢媚媚 苏震 罗胜男

肾间质纤维化（renal interstitial fibrosis，RIF）是多种病因导致的慢性肾脏病进展为肾功能衰竭过程中肾组织发生的主要病理改变[1]。RIF的发生机制非常复杂，至今仍未完全明确。microRNA（miRNA）是一类非编码单链小RNA，长约18～24个核苷酸，与靶基因配对引起其降解或抑制其翻译，进行转录后调控[2]。miRNA参与细胞凋亡、增殖、分化及炎症、免疫反应等重要的生理病理过程[3]。单侧输尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）能很好地模拟RIF过程，是经典的RIF造模方法。高通量测序又称下一代测序（next generation sequencing，NGS）[4]，常用于研究 miRNA。本研究使用NGS和实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）检测miR-132在UUO大鼠肾脏中的表达情况，并进行Gene Ontology（GO）分析和Pathway分析预测其靶基因，探讨miR-132是否参与RIF的发生、发展，为临床治疗RIF提供新的靶点。

1 材料和方法

1.1 材料 SD大鼠购于上海中科院；Trizol试剂购于美国Invitrogen公司；逆转录试剂盒及荧光定量试剂盒（SYBR Green I）购于日本东洋纺公司；RT-qPCR引物由上海Invitrogen公司设计并提供；PCR仪购于德国艾本德公司；RT-qPCR仪购于美国ABI公司。

1.2 方法

1.2.1 UUO模型的建立及病理检查 将24只雄性SD大鼠随机分为模型组和假手术对照（sham）组，每组12只。采用10%水合氯醛0.4g/kg腹腔注射麻醉大鼠，游离左侧输尿管至肾盂处，模型组建立UUO模型，即在近肾盂处和输尿管上1/3水平处用0号线结扎并切断输尿管，sham组仅游离左侧输尿管而不结扎、切断输尿管，逐层缝合腹壁。术后两组大鼠在相同条件下饲养，自由进食以及饮水，于术后第1、3天采用颈椎脱臼法分批（每批6只）处死获取肾脏组织标本。大鼠肾组织行Masson染色评估RIF程度。

1.2.2 NGS及小RNA分析 术后第1、3天模型组大鼠采用Trizol法提取手术侧和对侧肾组织的总RNA（确定RNA浓度及鉴定纯度采用紫外分光光度法），两侧分别取等量RNA进行混合，从中分离出小RNA，再逆转录成cDNA，进行PCR扩增后制成文库，使用Solexa测序法，采用Illumina Hiseq 2000测序仪测序。测序后的序列使用miRBase15.0数据库进行注释，将miR-132表达量归一化后计算fold-change值，公式为log2手术侧/非手术侧。本步骤委托华大基因中心完成。

1.2.3 RT-qPCR检测miR-132的相对表达量 采用Trizol法提取术后1、3d模型组和sham组的总RNA，使用特异性茎环引物进行逆转录反应，反应体系20μl，包括总 RNA 3μg、Oligo（dT）18 2μl、M-MLV 逆转录酶 1μl、RNase inhibitor 1μl、dNTP 1μl、DEPC 水加至20μl。反应条件为 16℃ 30min，42℃ 30min，70℃ 15min，结束后反应产物于-20℃保存。RT-qPCR采用SYBR Green 法，反应体系 20μl，其中前向引物 1.5μl、反向引物 1.5μl、 逆 转 录 产 物 1μl、plus solution 2μl、SYBR Green I Master mix 10μl、双蒸水加至 20μl。反应条件为95℃ 120s预变性，95℃ 15s变性，60℃ 60s退火延伸，40个循环，所有样品均作3个复孔。采用2－ΔΔCt法计算相对表达量[5]，miR-132以U6为内参。ΔΔCt=[Ct miR-132（模型组）－Ct内参（模型组）]－[Ct miR-132（sham 组）-Ct内参（sham 组）]，sham 组的 ΔΔCt为 0[6]。

1.2.4 GO和Pathway分析 选择Targetsan 5.1数据库预测miR-132的靶基因。基于GO和KEGG数据库，对预测的靶基因分别进行GO注释（功能注释）和Pathway（信号通路）注释，而后采用 χ2检验和 Fisher’s精确检验，计算GO以及Pathway的显著性水平（标准为P＜0.05），得到具有显著性意义的GO和Pathway注释，然后从中挑选出可能与RIF有关的GO和Pathway注释，取两者所属靶基因的交集，获得具有显著性意义的靶基因。

1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件。正态分布的计量资料以表示，方差不齐者比较采用非参数Mann-WhitneyU检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肾组织Masson染色结果 sham组术后第1、3天肾组织未见异常。模型组术后第1天肾单位和间质基本正常，术后第3天肾小管管腔轻度扩张，间质轻度水肿，可见散在间质单个核细胞浸润，肾小球结构尚正常，见图 1（插页）。

2.2 NGS分析miR-132差异表达 与非手术侧相比，手术侧术后第1、3天均表达上调（均P＜0.01），术后第3天上调幅度较术后第1天大，见表1。

表1 NGS分析miR-132差异表达

2.3 RT-qPCR检测miR-132的相对表达量 术后第1天模型组miR-132相对表达量为6.17±0.67，sham组为1±0；术后第3天模型组miR-132相对表达量为8.21±0.54，sham 组为 1±0；与 sham 组相比，术后第 1、3天模型组miR-132表达均明显上调（均P＜0.05），且术后第3天上调幅度较术后第1天大。

2.4 GO和Pathway分析结果 经Targetsan 5.1数据库预测靶基因后，得到226个靶基因，对其进行GO和Pathway注释取交集后，得到9个有显著性意义的靶基因，分别为 Ep300、Ⅱ1a、Rras2、Ppp2r5e、Ccng1、Capn2、Ccl25、Ocln、Nrcam。

3 讨论

近年来miRNA成为研究脏器纤维化的热点，包括肝脏纤维化[7-8]、心脏纤维化[9-10]、肺纤维化[11-12]等。Mann等[13]发现miR-132作为甲基化CpG结合蛋白2（methyl-CpG binding protein 2，MeCP2）的翻译抑制物而参与肝脏纤维化发生，目前鲜有文献报道miR-132与RIF之间的关系。

本研究中模型组术后第1天肾组织结构未见明显病变，术后第3天被认为处于RIF早期阶段，sham组未见异常。与sham组相比，术后1、3d模型组miR-132表达上调，相同时间点与非手术侧相比，手术侧miR-132表达上调，两项结果都显示术后第3天的上调幅度较术后第1天大，提示miR-132表达上调可能参与早期RIF的发生、发展。

本研究中miR-132经预测、分析得到9个靶基因，其中Ep300在小鼠视交叉上核中证实是miR-132的靶基因[14]。Ep300是E-钙黏附蛋白的转录激活因子，Ep300下调可以使E-钙黏附蛋白表达下调，激活上皮间质细胞转分化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）过程[15]，而EMT是肾脏间质纤维化发生、发展的关键环节。Ⅱ1a所编码的是IL-1，涉及多种炎症、免疫反应，IL-1通过调节TGF-β表达与生物活性而调控EMT[16]。Rras2编码的蛋白在控制细胞增殖的信号转导通路中起着重要的作用。Sharma等[17]报道Rras2通过激活Raf/MAPK通路介导NIH3T3成纤维细胞的转化。

Ppp2r5e是调节细胞调亡的重要因子。Ppp2r5e在人胃癌组织中表达下调，被认为是miR-23a的靶基因，通过促进凋亡来抑制胃癌细胞的生长。Ccng1编码的细胞周期蛋白G1参与细胞凋亡与增殖、DNA损伤修复等多种生理过程，Li等[18]发现Ccng1是miR-9的下游靶基因，在卵巢癌化疗耐药细胞中表达明显上调。

Capn2编码的钙蛋白酶2参与细胞骨架重塑，细胞信号转导，细胞增殖，细胞周期的进展，细胞凋亡等生理活动，Chen等[19]研究发现在人肝癌细胞中下调Capn2基因可以减少基质金属蛋白酶9（matrix metalloprotein-9，MMP-9）的分泌，MMP-9可降解多种细胞外基质蛋白。Ccl25通过对骨髓源性肝干细胞具有趋化作用而参与肝脏纤维化发生、发展过程。Ocln编码的紧密连接蛋白，是细胞间紧密连接的重要组成部分，在紧密连接的结构和功能维持中起着重要作用。Nrcam编码的神经细胞黏附分子能介导细胞间和细胞与细胞外基质间的黏附作用。

在具体的GO注释中，Ⅱ1a正向调节血管再生；Capn2参与缺氧应答；Ep300参与缺氧应答、调节胶原蛋白生物合成。在具体的Pathway注释中，Ep300参与TGF-β信号通路；Rras2、Ⅱ1a参与MAPK信号通路；Il1a、Capn2参与细胞凋亡通路。以上功能注释和参与的信号通路与肾间质纤维化的发病机制相关。

综上所述，笔者推测miR-132表达上调可能通过以上靶基因参与激活EMT、细胞凋亡、减少细胞外基质蛋白降解等过程而参与早期RIF的发生、发展，且可能是RIF进展中的一个促进因子。进一步研究需对预测的miR-132靶基因进行鉴定。