右美托咪定对小鼠皮肤/肌肉切口牵拉所致持续性术后疼痛的作用

杨娟 周璟 郭小文

持续性术后疼痛（persistent postsurgical pain，PPSP）是手术后并发的一类疼痛综合征。PPSP的发生率可能比人们想象中的要高，大约为10%～50%，其中重度疼痛占2%～20%[1]。为研究PPSP的发生机制，Flatters等[2]于2008年制作了大鼠皮肤/肌肉切口牵拉（skin/muscle incision and retraction，SMIR）模型，该模型是模拟临床切口牵拉手术的一种新型PPSP模型。此外，临床上PPSP大多数是持续性的、没有外界刺激的、自发性的[3]，而传统的慢性疼痛模型，多数测试机械性、冷或热触诱发痛，很难对动物的自发痛行为进行测量和评价[4]。既往已有报道将条件性位置范式中的条件性位置偏爱（conditioned place preference，CPP）用于动物模型自发痛的研究[5]。右美托味定是一种新型α2肾上腺受体（a2-adrenergic receptor，α2-AR）激动剂，是近来颇受麻醉界关注的药物[6-7]，且有实验证明右美托味定可以引起实验大鼠的CPP[8]。本研究采用CPP研究小鼠SMIR模型的自发痛，并探讨右美托咪定对SMIR小鼠触诱发痛及自发痛的影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物 健康成年雄性C57BL/6小鼠107只，6～8周龄，体重20～35g，由浙江大学实验动物中心提供。饲养于温度（25±1）℃、湿度（60±5）%、昼夜交替环境中，自由进食饮水。实验前，所有小鼠至少提前3d适应实验环境，提前30min适应行为学测试环境。

1.2 主要试剂和器材 0.9%氯化钠注射液（浙江慈溪制药厂）；戊巴比妥钠（中国医药集团上海公司）；右美托味定（江苏恒瑞医药股份有限公司）；von Frey纤毛刺激仪（阿根廷North Coast Medical公司）；辐射热痛敏刺激仪（上海玉研科学仪器有限公司）；电子天平（德国Sartorius公司）。

1.3 方法

1.3.1 造模方法 SMIR模型制备模拟Flatter等[2]大鼠造模方法。具体方法如下：小鼠腹腔注射戊巴比妥钠40mg/kg麻醉后置于仰卧位固定，剔除小鼠右侧后肢中部手术区域鼠毛，75%乙醇反复擦拭手术区域显现隐静脉，在隐静脉内侧3mm处作一长1.0～1.3cm的皮肤切口，暴露浅层股薄肌，钝性分离浅层肌肉，见到白色内收肌群肌腱筋膜，置入自制宽为1cm显微牵开器。拉开皮肤肌肉，可见白色内收肌群筋膜，持续牵开1h。在牵拉过程中，隐神经被牵开器拉伸并移位，但由于其处于肌肉表层而并没有受坚硬物体如骨头等压迫。牵开期间切口用无菌生理盐水纱布保湿，1h后缝合皮肤肌肉，注意术中保温。假手术组（Sham组）仅分离暴露肌肉1h，不用牵开器牵拉，其余步骤相同。

1.3.2 实验动物分组 按照实验设计将实验分为以下3部分：（1）将18只小鼠随机分为SMIR组及Sham组，各9只；两组小鼠分别于术前1d、术后第1、3、7、10、14、18d进行机械痛阈值测试（paw withdrawal threshold，PWT）和热缩足潜伏期测试（paw withdrawal latency，PWL）测试。（2）另选取75只小鼠随机分为SMIR组及Sham组，术后第3天行PWT测试后，SMIR组分别腹腔注射右美托咪定 0.4μg/kg（10只）、2μg/kg（10只）、10μg/kg（9只）和 0.9%氯化钠注射液 10ml/kg（10只）；Sham组分别腹腔注射右美托咪定0.4μg/kg（9只）、2μg/kg（9只）、10μg/kg（8只）和 0.9%氯化钠注射液10ml/kg（10只）；两组小鼠给药0.5h后再次行PWT测试。（3）另选取14只小鼠随机分为SMIR组8只及Sham组6只，术后第4天行CPP实验：SMIR组及Sham组腹腔注射右美托咪定10μg/kg。

1.4 行为学测试

1.4.1 PWT 将实验小鼠放入有机玻璃隔间（10cm×10cm×10cm），间距为1cm，置于距离桌面40cm的孔径2mm×2mm金属网格平台上。实验动物在测试开始前3d适应实验环境，每天在测试环境中放置0.5h。适应3d后用，依照Dixon等[9]报道的“up and down”法进行，能够使50%小鼠产生缩足反射的强度即为小鼠机械缩足反射阈值。

1.4.2 PWL 将有机玻璃箱置于3mm玻璃板上，小鼠适应环境30min后用卤钨丝灯发出的热痛刺激仪（10V，50W，光斑直径0.8cm）照射小鼠足底。照射开始至小鼠出现抬腿回避时为PWL值。自动切断时间为20s，以防止组织烫伤。热刺激强度在整个实验过程中维持一致，并保持玻璃板干燥，控制检测室内温度（20±2）℃，保持环境安静。每只小鼠测试3次，每次间隔3min，取3次平均值为大鼠PWL值，该值表示小鼠热缩足潜伏期。

1.4.3 CPP 小鼠造模后，放置于CPP三箱中自由适应2d，每天适应30min。第3天对小鼠进行15min的监控录像，行CPP测试：倘若每只小鼠在单侧条件箱停留时间超过总时间（900s）的80%（720s）或者少于总时间的20%（180s），即视为初始有偏爱状态而被淘汰。第4天对经过筛选的小鼠行药物与条件箱配对。上午小鼠腹腔注射0.9%氯化钠注射液后，立即放入固定的一侧条件箱15min。经过4h后，小鼠腹腔注射特定药物后立即放入固定的另一侧条件箱15min。结束后立即取出放回原来鼠笼并放入鼠房。20h后再次对小鼠进行15min的偏爱测试，统计小鼠在两侧条件箱中的停留时间，其差值即为偏爱指数。

1.5 统计学处理 采用GraphPad Prism7.0统计软件及绘制直方图。计量资料以mean±SEM表示，组间比较采用two way RM ANOVA检验，两两比较采用SNK-q检验 和Tukey’s检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠皮肤/肌肉切口牵拉模型疼痛行为学测试

2.1.1 两组小鼠不同时点PWT的比较 两组小鼠术前1d PWT无统计学差异；与Sham组相比，SMIR组PWT术后第1天即发生显著降低，持续降低至术后第10天，之后逐渐增高，至术后第18天几乎恢复正常水平。Sham组大鼠同侧足底术后PWT与术前相比无统计学差异，见表1。

2.1.2 两组小鼠不同时点PWL的比较 两组小鼠术前PWL比较无统计学差异。SMIR组小鼠术后第1、3、7、10、14、18天 PWL与术前及Sham组相比均无统计学差异（均P＞0.05），见表2。

2.2 右美托咪定对SMIR小鼠术后疼痛的影响

2.2.1 触诱发痛 生理盐水对照组中给予0.9%氯化钠注射液前后PWT比较无统计学差异（图1a）。给予右美托咪定 0.4μg/kg、2μg/kg 0.5h后，SMIR 小鼠 PWT与给药前相比均无统计学差异；Sham组也无统计学差异（图1b、c）。给予 10μg/kg右美托咪定后 SMIR组PWT与给药前相比有统计学差异；而Sham组给药前后PWT无统计学差异（图1d）。

2.2.2 自发痛 Sham组小鼠给药前右美托咪定配对箱和生理盐水配对箱停留时间差值为（-35.6±58.1）s，给药后右美托米定配对箱和0.9%氯化钠注射液配对箱停留时间差值为（-16.7±61.5）s（图 2a）；两者差值相比无统计学差异（图2b）。SMIR组小鼠给药前右美托米定配对箱和0.9%氯化钠注射液配对箱停留时间差值为（-61.5±40.6）s，给药后右美托米定配对箱和0.9%氯化钠注射液配对箱停留时间差值为（75.9±48.7）s（图2c）；两者差值相比有统计学差异（图2d）。

3 讨论

研究术后疼痛的模型常用足底切口模型[10]，然而该模型形成的疼痛持续时间比较短暂，只有大约5d，而临床上胸科手术及腹股沟疝气手术等部分患者会出现长达数月甚至数年的慢性疼痛[11]。PPSP形成机制尚且不清，而临床发病人群庞大，因此急需进一步深入研究。2008年Flatters等[2]发明了大鼠SMIR模型，但基因敲除大鼠较少，难以在基因层面进行深入研究，因此本实验采用成年雄性C57BL/6小鼠，将该SMIR模型拓展到小鼠上，检测该模型的稳定性，同时利于后期基因水平深入地研究疾病机制。实验结果与Flatters等实验结果相符。说明该模型作为研究PPSP具有一定的稳定性。可以进一步在基因水平研究PPSP的发生机制。

表1 两组小鼠不同时点PWT的比较（g）

表2 两组小鼠不同时点PWL的比较（s）

图1 腹腔注射不同剂量右美托咪定前后Sham组和SMIR组小鼠PWT的变化及比较（a：生理盐水；b：0.4μg/kg；c：2μg/kg；d：10μg/kg；与 Sham 组比较，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001）

图2 腹腔注射0.9%氯化钠注射液及右美托咪定前后SMIR小鼠CPP的变化及比较 （a、b：Sham组小鼠没有出现CPP；c、d：SMIR组小鼠出现 CPP；*P＜0.05）

右美托咪定作为α2肾上腺素能受体激动剂，具有镇静、镇痛、抑制交感神经及抗焦虑等多种作用。本研究通过参考以往文献[12]及预实验结果选用0.4μg/kg、2μg/kg和10μg/kg 3个浓度梯度，实验发现右美托咪定对SMIR术后的机械性触诱发痛有明显的缓解作用，且10μg/kg右美托咪定能够诱发出位置偏爱，说明其对自发性、随机性和持久性的自发痛也有镇痛效果。本实验再次验证：右美托咪定不仅具有良好的镇静效果，还具有抑制触诱发痛和自发痛的双重镇痛效果，是一种很有潜力的镇痛药物。

本研究结果显示小鼠行SMIR术后与术前相比，机械痛阈明显下降，可以持续至少14d；右美托咪定可以剂量依赖性地提高SMIR小鼠PWT值且10μg/kg右美托咪定可以改善SMIR小鼠的自发痛。笔者从行为学上研究了右美托咪定对小鼠持续性术后疼痛的镇痛作用，可能需要进一步排除其对模型小鼠记忆力、血脑屏障等相关混杂因素的影响。PPSP的机制非常复杂，本实验并没有对其进行深入研究；此外，右美托咪定镇痛的电生理学机制、分子生物学机制、细胞内机制并不十分清楚，均有待于我们下一步实验加以深入研究。