苦参素对肝癌Bel-7404细胞的增殖、丝裂原活化蛋白激酶1及细胞周期蛋白D1表达的影响▲

邓志华 黄赞松 曹 聪 胡高裕 黄桂柳 覃小珊

(广西右江民族医学院附属医院消化内科，百色市 533000，电子邮箱：369839795@qq.com)

原发性肝癌(简称肝癌)是全球三大恶性肿瘤之一。全世界范围内，在男性人群中肝癌死亡率位居所有恶性肿瘤的第2位，仅次于肺癌[1]。在我国，肝癌死亡率在所有肿瘤中排名第二[2]。目前手术仍为肝癌最主要的治疗方式，但发现晚、术后复发率高、易发生转移等因素导致大量患者失去手术治疗的机会，因此，寻找具有抗肝癌作用的药物具有重大意义。

研究表明丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)作为一种生存信号，可以促进细胞增殖、分化和生长[3],其可能是通过诱导细胞周期阻滞而影响肿瘤细胞增殖[4]。近年研究表明，MAPK信号通路与肝癌细胞增殖、凋亡密切相关[5-6]。细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)是细胞周期的启动因子，与肝癌细胞增殖有关[7-8]。在肝癌中,MAPK信号通路可能作用于Cyclin D1而影响肝癌细胞周期与增殖[9]。苦参素是从豆科植物苦参中提取的生物碱，近年来大量研究表明其可通过磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B、细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase，ERK)、缺氧诱导因子-1α等多种通路发挥抗肿瘤作用，但具体机制尚未明确[10-12]。本课题组的前期研究表明，苦参素具有抑制肝癌细胞增殖的作用[13-14]，其作用机制尚未完全明确，是否与MAPK信号通路及Cyclin D1相关也尚未明确。故本研究探讨苦参素对肝癌Bel-7404细胞增殖的抑制作用及对MAPK1及Cyclin D1表达的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器 人肝癌细胞株Bel-7404购自中科院上海细胞库。苦参素注射液购自湖北天药药业股份有限公司(国药准字：H20051156)。胎牛血清购自Gibco公司(批号：1982158C)，磷酸缓冲盐溶液(1×)、胰酶、青链霉素混合液(100×)、二甲基亚砜等购自北京索莱宝科技有限公司(批号：P1002、T1300、P1400、D2650)，杜氏改良伊格尔培养基购自赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司(批号：8119072)，四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)购自Amresco公司(批号：0793)，TRIzol试剂购自Invitrogen公司(批号：15596026)，反转录试剂盒购自Fermentas公司(批号：K1622)，实时荧光定量PCR试剂盒购自Ambion公司(批号：AM1005)，细胞培养板、细胞培养瓶、离心管等购自Corning公司。Cyclin D1、MAPK1引物由Invitrogen公司设计并合成。PCR仪购自Bio-Rad公司(型号：iQTM5 Optical Module)。自动酶标仪购自Thermo Fisher Scientific公司(型号：Multiskan MK3)。

1.2 实验分组 分为苦参素组、阴性对照组(Bel-7404细胞+不含药物的完全培养基)及空白对照组(不含细胞，只有完全培养基)。其中苦参素浓度为0.5 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL、8 mg/mL。经阴性对照组与空白对照组校正后得到对照组。

1.3 MTT法检测细胞增殖 取处于对数生长期Bel-7404细胞，常规消化并进行细胞计数，再接种至96孔板中，接种密度为5×104个/mL，置于饱和湿度、37℃、含5% CO2的培养箱中培养，待细胞贴壁(约4～5 h)后，取出96孔板，弃旧培养基，苦参素组加入含相应浓度药物的培养液，100 μL/孔，阴性对照组及空白对照组加入等量不含药物的培养液，每组设3个复孔。(3)MTT试验：继续培养48 h或72 h后，取出96孔板，于每个孔中加入5 mg/mL MTT 20 μL，继续于饱和湿度、37℃、含5% CO2的培养箱中培养4 h后取出细胞，吸掉上清液，加入二甲基亚砜150 μL/孔，置于37℃恒温箱中振荡10 min，使甲瓒结晶充分溶解后于自动酶标仪上检测各孔490 nm处吸光度值(A值)并计算抑制率。对照组A值=阴性对照组A值-空白对照组A值，实验组A值=药物组A值-空白对照组A值，抑制率=(对照组A值-实验组A值)/对照组A值×100%。以药物浓度为横坐标，以抑制率为纵坐标，绘制浓度效应曲线，求回归方程，计算出苦参素对Bel-7404细胞的半数抑制浓度(50% inhibitory concentration，IC50)。

1.4 实时荧光定量PCR法检测Bel-7404细胞中Cyclin D1及MAPK1的表达 (1)细胞制备：根据MTT结果，选择作用72 h的IC50值作为干预条件，接种细胞1瓶，按消化传代方法取等量细胞接种于2个新的培养瓶中，待细胞贴壁后，1瓶作为苦参素组，加入含IC50浓度(经计算为3.8 mg/mL)苦参素的培养液3 mL，另一瓶作为阴性对照组，加入等量培养液，作用72 h后进行后续实验。(2)提取细胞总RNA：取出上述制备好的细胞，用磷酸缓冲盐溶液冲洗细胞2次，1～2 min/次，加入适量TRIzol试剂裂解细胞，将裂解液移至新EP管中，加入适量氯仿，振荡摇匀、静置2～3 min后于11 327 r/min、4℃下离心15 min，吸取最上层含RNA的液体，再加入异丙醇沉淀，11 327 r/min、4℃下离心10 min，弃上清液后加入75%乙醇，振荡15 s，8 937 r/min、4℃下离心5 min后取沉淀，加入焦碳酸二乙酯水溶解RNA，混匀。于紫外分光光度计上测定RNA浓度。(3)反转录：取出上述提取的RNA及反转录试剂盒，按照试剂盒说明书制备反转录混合液，具体操作过程按照试剂盒说明书进行，合成的cDNA于-20℃中保存备用。(4)实时荧光定量PCR：参照试剂盒说明书，配制反应体系，各样品、各基因分管同机进行反应，引物序列如表1，每组设3个复孔，重复3次实验取平均值，反应条件为：预变性95℃ 10 min，退火、延伸95℃ 15 s，55℃ 1 min，共45个循环，溶解曲线分析55℃ 1 min，55～95℃ 30 s。以U6为内参，采用2-△△Ct法计算目的基因的相对表达量。

表1 引物序列

1.5 统计学分析 采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 苦参素作用Bel-7404细胞48 h及72 h后的抑制率 苦参素分别作用48 h及72 h后，各浓度苦参素组的抑制率均高于对照组，且抑制率随苦参素浓度的升高而升高(均P<0.05)。2 mg/mL、4 mg/mL、8 mg/mL苦参素组中，72 h抑制率均高于48 h(均P<0.05)。见表2。

表2 不同浓度苦参素作用Bel-7404细胞48 h及72 h后的抑制率比较(x±s，%)

注：与对照组比较，*P<0.05；与0.5 mg/mL苦参素组比较，aP<0.05；与1 mg/mL苦参素组比较，bP<0.05；与2 mg/mL苦参素组比较，cP<0.05；与4 mg/mL苦参素组比较，dP<0.05。

2.2 苦参素组Cyclin D1及MAPK1 mRNA表达 苦参素组Cyclin D1 mRNA相对表达量与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，而MAPK1 mRNA相对表达量高于对照组(P<0.05)。见表3。

表3 两组细胞Cyclin D1及MAPK1 mRNA相对表达量比较(x±s)

3 讨 论

近年来，大量研究表明，苦参素可通过磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶、ERK、缺氧诱导因子-1α等多种通路发挥抗肿瘤作用[10-12]。在肝癌中，苦参素可抑制肝癌SMMC-7721及HepG2细胞的增殖[15]，也可通过影响MAPK通路中的磷脂酰肌醇3-激酶及P38通路而抑制大鼠肝BRL-3A细胞的凋亡[16]；在食管癌中，苦参素可通过下调ERK1/2、Cyclin D1的表达，而诱导食管癌细胞Eca109发生凋亡[12]；此外，苦参碱可诱导视网膜细胞瘤细胞发生细胞凋亡及细胞周期出现阻滞，其机制可能与其下调Cyclin D1蛋白表达有关[17]。以上研究结果提示苦参素抗肿瘤作用机制与MAPK信号通路有关，且可能通过Cyclin D1起抗肿瘤作用。

MAPK信号通路是参与细胞生长、增殖、分化等过程的重要通路，几乎涉及生命的各个过程，该信号通路主要包括ERK、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、P38 MAPK及ERK5等信号通路。MAPK1又称为ERK2，是MAPK/ERK信号通路的一个成员，也是MAPK信号通路的一个关键激酶，且在细胞增殖中起重要作用[18]。受到外界信号的刺激后，MAPK1发生磷酸化，作用于下游的细胞周期蛋白如Cyclin D1蛋白，最终促进细胞从G1期进入S期[19]。

研究表明，苦参素可阻滞细胞周期，抑制细胞增殖[15-17,20-21]。本研究结果显示，苦参素分别作用48 h及72 h后，各浓度苦参素组的抑制率均高于对照组，且抑制率随苦参素浓度的增加而升高(均P<0.05)，且2～8 mg/mL的苦参素组中，72 h抑制率均高于48 h(P<0.05)。这提示苦参素可抑制肝癌细胞的增殖，且是一定的浓度及时间依赖性。

此外，苦参素组MAPK1 mRNA相对表达量高于对照组(P>0.05)，而Cyclin D1 mRNA相对表达量与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，提示苦参素作用后Cyclin D1基因表达无变化，但可上调MAPK1基因表达。这与既往研究[12,15-17,22]有相似之处也有矛盾的地方，有学者发现苦参素可抑制肿瘤细胞增殖，且可能与MAPK信号通路有关，这与本研究结果相似；但也有学者发现苦参素可通过MAPK/Cyclin D1通路影响肿瘤细胞增殖，或发现苦参素可作用于Cyclin D1影响细胞周期，但不是通过ERK1/2信号通路起作用，这是与本研究结果不一致。究其原因，考虑可能与肿瘤细胞类别、病理类型、细胞状态等多种因素不同相关。

综上所述，苦参素可抑制肝癌细胞增殖，这可能与MAPK信号通路有关。但本研究只探讨了MAPK1基因表达的变化，未能分析其蛋白表达是否发生改变；且MAPK通路包括多条信号通路，苦参素对各通路表达的影响也尚不明确，将来可进一步探讨苦参素对MAPK各信号通路的影响。