神经精神性狼疮患者血清抗N-甲基-D-天[门]冬氨酸受体亚单位2A抗体水平及其临床意义▲

曲 航 黄 宇 廖 浩 裴文迪 黄 琴

(1 南方医科大学第二临床医学院，广东省广州市 510282，电子邮箱：15265420979@163.com；2 南方医科大学南方医院风湿免疫科，广东省广州市 510515)

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是一种全身性自身免疫性疾病，临床表现复杂,可以累及多个系统，其中神经精神性狼疮(neuropsychiatric systemic lupus erythematosus,NPSLE)是SLE的严重并发症[1]。美国风湿病学会(American College of Rheumatology,ACR)将NPSLE分为19种，包括头痛、癫痫、脑血管病、无菌性脑膜炎、精神障碍、认知障碍等。近年多项研究表明，NPSLE与自身抗体之间存在关联，如抗磷脂抗体、抗核糖体P蛋白抗体(anti-ribosomal P protein antibody，ARPPA)和N-甲基-D-天[门]冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartate receptor,NMDAR)抗体等[2-4]。

NMDAR是一种配体门控离子通道，由两个N-甲基-D-天冬氨酸受体亚单位(N-methyl-D-aspartate receptor subunit，NR)1亚基和两个NR2亚基组成四聚体，在认知、记忆功能和神经元的存活中起重要作用。多种颅脑病变与NMDAR的过度激活有关，如中风、慢性神经退行性疾病、癫痫、精神分裂症等[5-8]。目前越来越多的学者发现，神经元细胞上抗N-甲基-D-天[门]冬氨酸受体亚单位2A抗体(抗NR2A抗体)与NPSLE存在相关性，但具体与哪类神经精神症状相关，结论尚未明确，且这些研究主要集中在欧美人群，国内研究甚少[9-13]，因此分析抗NR2A抗体在中国狼疮患者中的表达情况具有重要意义。本研究探讨抗NR2A抗体在NPSLE中的表达水平及其与疾病活动度的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2011年1月至2015年1月就诊于南方医科大学南方医院的73例成年活动期SLE患者为研究对象。纳入标准：符合1997年ACR制订的SLE分类标准[14]，患者年满18周岁并有完整的临床资料。排除晚期肾功能衰竭、重度感染、既往有精神疾病史及糖皮质激素性躁狂症等患者。采用SLE疾病活动指数2000(SLE disease activity index-2000,SLEDAI-2000)评估疾病的活动性，SLEDAI-2000评分≥4分为处于活动期[15]。其中女64例，男9例，年龄18～62(28.03±9.82)岁，SLEDAI-2000评分5～30(11.00±3.90)分，均处于疾病活动期。根据1999年ACR提出的NPSLE分类标准[15]，将患者分为NPSLE组36例和非NPSLE组37例。NPSLE组中，女性32例，男性4例，发病年龄(28.4±11.4)岁；非NPSLE组中，女性32例，男性5例，发病年龄(30.2±13.2)岁。两组一般资料差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经南方医科大学南方医院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2 血清学指标的检测 收集患者清晨空腹肘静脉血5 mL，室温下静置30 min后，以1 500 r/min离心10 min分离血清，将含微粒的血清经低速离心净化(1 500 r/min，10 min)。血清标本分装在干燥的冻存管中，于-80℃冻存待检。采用酶联免疫吸附法，以肽抗原DWEYSVWLSN(DWEYS肽，购自北京华大基因有限公司)作为抗原，检测抗NR2A抗体的滴度[16]。检测步骤如下：96孔板每孔包被1 μg肽抗原，加入100 μL 10×磷酸缓冲盐溶液(phosphate-buffered saline，PBS)4℃过夜；每孔加入200 μL 10%胎牛血清室温下封闭1 h；用1×PBS液进行洗涤(洗液加满每孔，静置5 min，弃掉洗液，重新加满，重复洗涤3～6次后拍干)；在肽抗原处理过的96孔板中加入患者血清(1 ∶100稀释)，室温下孵育2 h；同样方法用1×PBS液洗涤3～6次，然后每孔加入200 μL过氧化物酶偶联的IgG抗体(1 ∶1 000稀释)37℃孵育30 min，再次洗涤3～6次，随后加入底物溶液A(过氧化氢还原溶液)和底物溶液B(四甲基联苯胺显色液)各50 μL/孔，37℃避光孵育15 min，最后加入终止液(H2SO4)50 μL/孔，孵育5 min终止反应；使用全自动酶标仪(BioTek公司，型号：ELX-800)读取450 nm处吸光值。以吸光度值作为抗NR2A抗体相对定量水平，组内和组间差异(变异系数)分别为5%和15%。

此外，采用酶联免疫吸附法测定抗核抗体、抗双链脱氧核糖核酸(double-stranded DNA，dsDNA)抗体；采用免疫印迹法测定抗干燥综合征抗原A(Sjögren′s syndrome antigen A，SSA)抗体、抗干燥综合征抗原B(Sjögren′s syndrome antigen B，SSB)抗体、ARPPA。采用免疫比浊法测定补体C3、C4水平。相关试剂盒均购自欧蒙公司，实验步骤按照说明书进行。

1.3 评估NPSLE患者神经精神情况 根据ACR对NPSLE神经精神症状的标准化定义[15]，结合患者临床表现、实验室检查、影像学表现及神经精神评估量表[17]，可将NPSLE患者神经精神症状分为两个亚群——中枢神经系统亚群和周围神经系统亚群。中枢神经系统亚群包括无菌性脑膜炎、脑血管病、脱髓鞘综合征、头痛、运动障碍、脊髓病、癫痫发作、急性精神错乱、焦虑、认知功能障碍、情绪失调和精神障碍；周围神经系统亚群包括格林-巴利综合征、自主神经病变、单神经病、重症肌无力、颅神经病变、神经丛病变、多发性神经病变。

1.4 统计学分析 使用GraphPad Prism 6.0软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以(x±s)表示，比较采用t检验；非正态分布的计量资料以M(P25，P75)表示，比较采用秩和检验；计数资料采用例数和百分率表示，比较采用χ2检验；相关性分析采用Pearson检验。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组患者SLEDAI-2000评分自身抗体及补体水平的比较 NPSLE组的SLEDAI-2000评分和血清抗ds-DNA抗体、抗NR2A抗体水平均高于非NPSLE组(P<0.05)。两组间抗核抗体水平、ARPPA阳性率、抗SSA抗体阳性率、抗SSB抗体阳性率、C3及C4水平比较，差异无统计学意义(均P>0.05)。见表1。

表1 两组SLEDAI-2000评分、自身抗体及补体水平比较

2.2 36例NPSLE患者神经精神情况 36例NPSLE患者发病以来总共发作69次神经精神症状，包含了19种NPSLE症状中的10种，其中出现枢神经系统亚群者占94.4%(34/36)，出现周围神经系统亚群者占5.6%(2/36)。主要的临床表现包括：癫痫发作占47.2%(17/36)，头痛占33.3%(12/36)，认知功能障碍占27.8%(10/36)，精神病(精神分裂症)占22.2%(8/36)，脑血管疾病占16.7%(6/36)。10例认知障碍NPSLE患者的抗NR2A抗体水平为(0.484±0.008)，其余26例无认知障碍NPSLE患者的抗NR2A抗体水平为(0.485±0.011)，两者差异无统计学意义(t=0.261，P=0.796)。

2.3 抗NR2A抗体水平与NPSLE患者病情的相关性 NPSLE组中，抗NR2A抗体水平与SLEDAI-2000评分、抗dsDNA抗体水平呈正相关(r=0.355，P=0.034；r=0.535，P<0.001)，与C3、C4水平呈负相关(r=-0.432，P=0.008；r=-0.378，P=0.023)。

2.4 抗NR2A抗体与ARPPA的关系 分别将36例NPSLE患者和37例非NPSLE患者分为ARPPA阳性组及ARPPA阴性组。在NPSLE患者中，ARPPA阳性组的抗NR2A抗体水平为(0.51±0.04)，高于ARPPA阴性组的(0.44±0.02)(t=6.987，P<0.001)；在非NPSLE患者中，ARPPA阳性组的抗NR2A抗体水平为(0.42±0.02)，高于ARPPA阴性组的(0.40±0.02)(t=2.848，P=0.007)。

3 讨 论

14%～75%的SLE患者可出现神经精神症状，NPSLE是SLE预后不良的表现[18]。NPSLE临床表现多样，包括亚临床的认知功能异常以及危及生命的脑血管病变等。国外文献报告，NPSLE常见临床表现为认知障碍(6.6%～80.0%)、情感障碍(7.4%～65.0%)、头痛(12.2%～28.3%)、癫痫(7.0%～20.0%)、脑血管病变(5.0%～18.0%)[19]。本研究中36例NPSLE患者总共发作69次神经精神症状，以癫痫发作(47.2%)、头痛(33.3%)、认知功能障碍(27.8%)为主。

NMDAR是谷氨酸受体家族的一个亚组，介导中枢神经系统的快速兴奋性神经传递，其与兴奋性神经递质如谷氨酸和天冬氨酸结合，可引起神经元细胞膜通透性增强，产生兴奋性突触后点位，但NMDAR的过度兴奋会导致神经元的损伤和死亡，影响空间记忆的巩固和维持，进而引起相应的认知功能障碍[20]。有文献报告，将抗NR2谷氨酸受体结合抗体(从SLE患者血清中提取抗体并纯化后得到)注射至小鼠大脑中，可以导致非炎症性神经元细胞凋亡[16]。在本研究中，抗NR2A抗体在所有SLE患者中都有表达，但NPSLE组患者的抗NR2A抗体水平高于非NPSLE组患者(P<0.05)，提示抗NMDAR抗体可能参与了NPSLE的发病机制。目前，抗NMDAR抗体是否与NPSLE认知障碍相关仍存在争议。Hirohata等[9]发现，高水平的抗NMDAR抗体与NPSLE症状明显相关，尤其是焦虑障碍、认知障碍和精神病。周艳[10]发现，认知障碍的NPSLE患者血清抗NMDAR抗体表达水平明显高于认知功能正常的NPSLE患者。Lapteva等[11]发现，SLE患者的NMDAR抗体浓度和情绪低落有关，但和认知障碍无关。Harrison等[12]也发现血清抗NMDAR抗体阳性与认知障碍没有关联。本研究结果显示，10例认知障碍的NPSLE患者与26例认知功能正常的NPSLE患者血清抗NR2A抗体水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)，因此抗NR2A抗体或与认知障碍没有明确的相关性。

抗NR2A抗体最初被认为是抗DNA抗体。Degiorgio等[16]的研究显示，部分含有抗dsDNA抗体的SLE患者血清可与NR2A和NR2B亚基产生交叉反应。然而，Husebye等[13]发现，31%的SLE患者的血清可与抗NR2A抗体发生特异性反应，而抗NR2A抗体与抗dsDNA抗体之间并无关联，这可能是由于该研究中NPSLE患者人数过少(仅占5.5%)。本研究结果显示，NPSLE组中抗NR2A抗体水平与SLEDAI-2000评分、抗dsDNA抗体水平呈正相关，与C3、C4水平呈负相关(P<0.05)。这提示抗NR2A抗体水平与NPSLE病情活动相关，或可成为评估NPSLE疾病活动度的血清学指标。

ARPPA是一种细胞质抗体，一直被认为是一种SLE的特异性抗体，与SLE的神经精神损害和病情活动有很大的相关性[21]。ARPPA的靶抗原为胞浆核糖体蛋白，其共同抗原表位包含3个高度保守的羧基末端残基，即P0、P1和P2。ARPPA通过一种高质量的质膜蛋白——神经表面P抗原(neuronal surface P antigen，NSPA)，实现在细胞膜上的暴露。这种质膜蛋白专一地表达在神经元的特定区域，包括与认知、记忆及情感有关的区域[3]。近年研究表明，ARPPA与NPSLE的发病过程有关[22-23]。Segovia-Miranda等[24]发现NSPA参与谷氨酸能突触传递的过程和海马记忆的可塑性，并介导ARPPA在这些过程中的损害效应，且当ARPPA进入共表达NSPA和NMDA受体的脑区域时，可能出现认知障碍以及其他弥漫性NPSLE表现。Bravo-Zehnder等[25]发现ARPPA与海马神经元细胞表面的NSPA结合，导致神经元的凋亡或功能障碍。本研究结果显示，ARPPA阳性率在NPSLE组和非NPSLE组之间差异并无统计学意义(P>0.05)，但有趣的是，在ARPPA阳性的NPSLE患者中抗NR2A抗体水平高于ARPPA阴性的患者(P<0.05)，说明这两种抗体可能存在相关性，均在NPSLE发病过程中起重要作用。

综上所述，NPSLE患者的抗NR2A抗体水平高于非NPSLE患者，且与疾病活动度有关，但与认知障碍并无明确的相关性。此外，在ARPPA阳性的NPSLE患者中抗NR2A抗体表达明显升高。因此，抗NR2A抗体可能在NPSLE的发病机理中起重要作用，但是其具体的作用机制尚需要进一步探讨。