AMPK调节小鼠耐力变化的机制及结果分析

曾韬

（荆楚理工学院医学院，湖北 荆门 448000）

0 引言

耐力是长时间进行肌肉工作的运动能力，可以分为无氧耐力、有氧耐力，运动时能量供应存在差异。以长时间有氧代谢为主要供能方式的，是有氧耐力。骨骼肌利用氧的能力，主要与有氧耐力相关。骨骼肌有氧代谢能力上升的表现，是肌纤维氧化酶活性的上升。增加肌肉缓冲能力、能源底物转运、氧运输能力，有利于耐力的提升[1]。AMPK在线虫到哺乳动物的各种真核细胞中广泛存在，主要形式是异源三聚体。运动中肌肉收缩导致的能量变化，可以由AMPK感受到，并且激活[2]。激活AMPK会对靶代谢蛋白进行磷酸化，将消耗ATP通路关闭，多条代谢途径分解，对脂肪和糖的代谢进行调控。虽然在骨骼肌能量代谢中，有AMPK参与调控，并且与运动耐力、运动训练有关，但目前，尚不清楚AMPK对运动耐力调控的作用机制。本次主要探讨AMPK调节小鼠耐力变化的机制及结果，现报告如下。

1 资料和方法

1.1 一般资料

使用雄性C57/BL6小鼠54只，八周龄，小鼠健康，体重（20.3 0.7 ）g。使用主要仪器凝胶成像系统、紫外分光光度计、超低温冰箱、低温高速离心机、垂直电泳槽、超纯水仪、冰冻切片机等等。主要试剂有丙烯酰胺、蛋白酶抑制剂、亚甲基双叉丙稀酰胺、磷酸蛋白酶抑制剂、琼脂糖、AMPKα、ECL增敏化学发光底物试剂等等。

1.2 实验方法

使用八周龄雄性C57/BL6小鼠54只，进行随机分成对照组、运动一小时后组和运动耗竭后组（n=18），采用小鼠跑台实验（即三组小鼠放入跑台每天以10 m/min运动15 min，预适应一周）的方式进行前期适应。适应期结束后，对照组的小鼠直接取跖肌、比目鱼肌、后肢背侧腓肠肌。运动一小时后组和运动耗竭组（判断小鼠耗竭标准：10s内连续被电击3次）的小鼠放入跑台，让该两组小鼠以15 m/min的运动速度进行小鼠的耐力实验，运动一小时后组，在小鼠试验后，一个小时后取跖肌、比目鱼肌、后肢背侧腓肠肌。运动耗竭组，在小鼠运动耗竭后，立即取跖肌、比目鱼肌、后肢背侧腓肠肌。然后分别提取三组小鼠的总蛋白或者RNA。三组小鼠总蛋白或者RNA提取步骤一致。

总蛋白提取步骤：首先配置组织蛋白裂解液，配置方法是采用Tris（体积1 mL，浓度1 mol/L）、EDTA（体积0.4 mL，浓度0.5 mol/L）、NaCl（体积3 mL，浓度3 mol/L）、Brigi（体积8.75 mL，浓度10 %）、NP40（体积1.25 mL，浓度10 %）等试剂加ddH2O100 mL，使用时加入蛋白酶抑制剂；然后取50 -100 mg的肌肉组织加入到1mL的组织裂解液中，用均浆器在冰上充分均浆，裂解30 min；之后通过4℃的温度和12000 g离心20 min，取上清，获取总蛋白。

RNA提取步骤：取肌肉组织，加入1 mL的Trizol试剂均浆，20 ℃的室温下放置20 min，然后加入200 μl的氯仿，使用振荡法进行混均，在冰上放置3 min，通过4 ℃的温度和12000 g离心15 min，取上清，加入同体积的异丙醇，混均，室温下放置15 min，重复离心操作，然后移出上清，加入70 %的乙醇进行洗涤、沉淀，获取RNA。

1.3 统计学分析

采用SPSS 20.0软件对本次调查的所有数据进行统计分析，其中用%表示计数资料，计数资料的检验采用χ2，用（）表示计量的资料，计量资料检验采用t值。当P＜0.05，表示两组数据差异明显，具有统计学意义。

2 结果

2.1 AMPK激活对运动过程中小鼠腓肠肌内不同肌纤维类型基因表达的影响

小鼠运动后一小时，与对照组相比，快肌纤维基因MHC-Ⅱb mRNA表达下降，数据差异有统计学意义（P＜0.05），慢肌纤维基因MHC-Ⅱa mRNA表达增加59%，数据差异有统计学意义（P＜0.05）。小鼠运动耗竭后，快肌纤维基因MHC-Ⅱb mRNA表达有一定升高，高于对照组，数据差异有统计学意义（P＜0.05），MHC-Ⅱa mRNA表达有一定下降。过渡性肌纤维MHC-Ⅱd mRNA表达持续增加，见表1。

表1 AMPK激活对运动过程中小鼠腓肠肌内MHCs mRNA表达的影响

2.2 AMPK激活对运动过程中小鼠比目鱼肌内不同肌纤维类型基因表达的影响

小鼠运动后一小时，相比对照组，比目鱼肌内快肌纤维基因MHC-Ⅱb mRNA表达明显下降，数据差异有统计学意义（P＜0.05），慢肌纤维基因MHC-Ⅱa mRNA表达明显增加，数据差异有统计学意义（P＜0.05）。小鼠运动耗竭后，快肌纤维基因MHC-Ⅱb mRNA表达出现上升，但仍然低于对照组，数据差异有统计学意义（P＜0.05），慢肌纤维基因MHC-Ⅱa mRNA和MHC-Ⅰ表达逐渐恢复到对照组水平。过渡性肌纤维MHC-Ⅱd mRNA表达，先上升，后下降，见表2。

表2 AMPK激活对运动过程中小鼠比目鱼肌内MHCs mRNA 表达的影响

2.3 AMPK激活对运动过程中小鼠跖肌内不同肌纤维类型基因表达的影响

小鼠运动后一小时，相比对照组，跖肌内快肌纤维基因MHC-Ⅱb mRNA表达明显下降，数据差异有统计学意义（P＜0.05），慢肌纤维基因MHC-Ⅱa mRNA表达明显增加，数据差异有统计学意义（P＜0.05）。小鼠运动耗竭后，快肌纤维基因MHC-Ⅱb mRNA表达出现上升，数据差异有统计学意义（P＜0.05），慢肌纤维基因MHC-Ⅱa mRNA表达逐渐恢复到对照组水平。过渡性肌纤维MHC-Ⅱd mRNA表达，先下降，后上升，见表3。

表3 AMPK激活对运动过程中小鼠跖肌内MHCs mRNA表达的影响

2.4 AMPK激活对运动过程中小鼠不同纤维类型肌肉中PGC-lα基因表达的影响

从小鼠运动过程中，到小鼠运动耗竭，相比对照组PGC-lαmRNA表达不断上升。小鼠运动后一小时，在跖肌、比目鱼肌、腓肠肌中PGClαmRNA表达，相比对照组明显增加，数据差异有统计学意义（P＜0.05）。小鼠运动耗竭，在跖肌、比目鱼肌、腓肠肌中PGC-lαmRNA表达，相比对照组明显增加，数据差异有统计学意义（P＜0.05），见表4。

表4 AMPK激活对运动过程中小鼠不同纤维类型肌肉中PGC-lα基因表达的影响

3 讨论

肌肉活动时的能量供应代谢特点包括，第一，当运动强度耗能速率，超过有氧产能的最大速率，为满足代谢需求，要用产能更快的无氧方式，无氧代谢的终产物会对其代谢过程产生限制，无氧功能只是暂时的[3]。第二，随着运动强度的变化，肌肉活动对能量也有不同的需求。因此需要产能速率匹配耗能的强度。第三，完成所有运动时，必须是连续的能量供应，否则能量供应中断，会影响肌肉工作[4]。第四，在完成不同强度的运动时，肌肉运动强度、优先启动的功能系统，与耗能速率和产能的匹配关系有关。第五，有氧供能是最基本的代谢方式，具有完善的调节系统、代谢方式、代谢途径等。清除无氧代谢的产物，以及恢复能源物质，需要有氧代谢。运动锻炼会增加线粒体数量，增强功能活动，辅激活因子PGC-lα对线粒体的数量有重要的影响[5-6]。本次研究显示，PGC-lαmRNA表达，呈现持续上升的趋势。在运动过程中，AMPK的激活，会使PGC-lα表达增加。AMPK直接将PGC-lα磷酸化，主要是第538位的丝氨酸，以及177位的苏氨酸。PGC-lα可以增强GLUT-4，以及有关的有氧代谢基因，对自身启动正反馈调控自身基因转录发生作用[7]。PGC-lα和MEF2C能够对慢肌纤维基因的转录发挥共同促进的作用。本次研究中显示，小鼠运动后一小时，快肌纤维基因表达受到抑制，慢肌纤维相关基因表达上升。小鼠运动耗竭后，慢肌纤维基因表达逐渐恢复到对照组的水平。推断与运动耗竭的情况下，小鼠体内出现严重代谢紊乱有关。同时也反映出，通过长期的适度的耐力训练，对慢肌纤维表达有促进作用，从而有利于运动耐力的提升。持续激活AMPK，对骨骼肌供能方式有明显的改善作用，能够有效增加运动耐力。皮下注射四周小鼠，使用AICAR，和有氧代谢相关的32个基因出现明显的表达增加，小鼠的运动能力上升[8]。在骨骼肌运动能力中，AMPK发挥着重要的作用。运动时p-AMPKα表达增加，通过加速分解代谢产能，对耗能的合成代谢进行抑制，使运动的骨骼肌能量供应获得保证，同时运动强度不同，对肌肉也有不同的影响。

综上所述，激活AMPK，能够增加PGC-1α mRNA转录活性，促进骨骼肌慢肌纤维相关基因转录，促进运动耐力的提升。