宫颈癌组织中Foxm1、ANGPTL4蛋白表达及临床意义

陈辉，樊茹佳，丁继侠

（1.河南工业大学医院妇科，郑州450001；2.河南省人民医院妇产科，郑州450003）

宫颈癌是发生在宫颈阴道部或移行带及宫颈管内膜交界处的恶性肿瘤，是发病率较高的妇科恶性肿瘤之一[1]。宫颈癌的发病与多种因素有关。早婚早育、人乳头状瘤病毒感染、性激素失调及子宫颈糜烂症等均为宫颈癌的重要发病诱因。流行病学研究[2]提示，宫颈癌的发病率具有明显的年轻化趋势，为提高其治疗效果，了解其具体发病机制具有重要意义。研究[3]发现，Foxm1蛋白在肝癌、基底细胞癌、肺癌及乳腺癌的组织中均存在明显的高表达，并提示Foxm1蛋白可能是肿瘤发生、发展过程中重要调控分子之一，但关于宫颈癌中Foxm1的研究较为缺乏。ANGPTL4可以激活整合素β1及β5调控FAK和PAK通路使表皮角质形成细胞迁移，这也为肿瘤细胞的转移研究提供了理论基础。本研究探讨了宫颈癌组织中Foxm1、ANGPTL4蛋白表达水平及其临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年1月-2018年3月河南省人民医院保存的宫颈癌组织标本72例，年龄35～62 岁，中位年龄 50～42 岁。纳入标准：（1）均经病理学确诊；（2）术前未接受放化疗等治疗；（3）临床病理资料保存完整。排除标准：合并有其他恶性肿瘤。同时选取正常宫颈组织标本35例作为对照，年龄34～64岁，中位年龄51.50岁。

1.2 实验方法 取适量宫颈癌组织石蜡包埋后连续切片，免疫组化染色法检测Foxm1、ANGPTL4蛋白表达，DAB显色。Foxm1蛋白抗体（批号：20160821）及ANGPTL4蛋白抗体（批号：20161102），DAB 显色盒及SP试剂盒均购于南京建成生物研究所。磷酸盐缓冲液代替一抗及阳性片分别作为阴性和阳性对照，高倍显微镜下观察Foxm1、ANGPTL4蛋白表达情况，具体染色方法严格依照SP试剂盒说明书进行。

Foxm1主要定位于细胞质和细胞核，ANGPTL4主要定位于细胞质，呈黄色表达。采用半定量积分法：（1）石蜡切片常规脱蜡、水化及抗原修复；（2）滴加 3% H2O2溶液；（3） 用正常山羊血清封闭；（4）滴加兔小鼠NF200特异性一抗（1：100），4℃孵育过夜；（5）次日37℃复温，滴加生物素标记羊抗小鼠IgG及辣根酶标记链酶卵白素工作液；（6）镜控DAB显色，苏木素复染，盐酸酒精分化，碳酸锂返蓝，最后梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，高倍显微镜观察。

对染色强度和阳性细胞比例进行评分：（1）染色强度：无着色为0分，淡黄色为1分，黄色为2分，棕褐色为3分；（2）阳性细胞比例：≤10%为0分，11%～25%为 1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分。（1）+（2）之和，≥4分为阳性表达[4-5]。

1.3 统计学处理 统计分析采用SPSS19.0软件，计数资料比较使用字2检验，相关分析采用Spearman秩相关分析。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 宫颈癌和正常宫颈组织Foxm1、ANGPTL4蛋白表达 宫颈癌组织Foxm1和ANGPTL4蛋白阳性表达率明显高于对照组，差异比较有统计学意义（P＜0.05），见表 1 和图 1、2。

表1 宫颈癌和正常宫颈组织Foxm1、ANGPTL4蛋白表达Tab 1 Expression of Foxm1 and ANGPTL4 in Cervical Carcinoma and Normal Cervical Tissues

图1 宫颈组织免疫组化染色图Fig 1 Immunohistochemical staining of cervical tissue

图2 宫颈癌和正常宫颈组织Foxm1、ANGPTL4蛋白阳性表达Fig 2 Positive expression of Foxm1 and ANGPTL4 protein in cervical cancer and normal cervical tissues

2.2 Foxm1、ANGPTL4蛋白表达与宫颈癌临床病理特征的关系 FIGO分期Ⅱ期、肌层浸润≥1/2、中低分化宫颈癌Foxm1蛋白阳性表达率明显高于Ⅰ期，肌层浸润＜1/2、高分化患者（P＜0.05），有脉管浸润宫颈癌ANGPTL4蛋白阳性表达率明显高于无脉管浸润（P＜0.05），见表 2。

表2 Foxm1、ANGPTL4蛋白表达与宫颈癌临床病理特征的关系Tab 2 Relationship between expression of Foxm1 and ANGPTL4 protein and clinicopathological features of cervical cancer

续表2 Foxm1、ANGPTL4蛋白表达与宫颈癌临床病理特征的关系Tab 2 Relationship between expression of Foxm1 and ANGPTL4 protein and clinicopathological features of cervical cancer

2.3 相关性分析 经Spearman秩相关分析，结果显示：Foxm1与ANGPTL4蛋白表达呈正相关（rs=0.301，P＜0.05），见表 3。

表3 相关性分析Tab 3 Relevance analysis

3 讨论

宫颈癌发病率在全世界女性恶性肿瘤中居第二位，占所有女性恶性肿瘤发病的13%。而现阶段关于宫颈癌的发生、发展机制仍存在分歧。肿瘤的侵袭转移是恶性肿瘤的主要特征，是引起恶性肿瘤患者死亡的主要原因，其过程复杂多变，且由多个因素动态分段调控。Foxm1蛋白含有多个糖蛋白配体及丝氨酸结构，可激活机体氧化应激蛋白酶，促进改变机体肿瘤微环境，进而加速癌细胞的持续增殖[8-9]。Foxm1的过度富集，能够转录调控增加p53或p16等癌基因的转录活性，促进肿瘤蛋白高翻译。最新的研究[10-11]提示Foxm1主要在胎儿平滑肌组织、肝肾组织及部分神经间质表达，但在人体分化组织阳性表达率较低，此外Foxm1蛋白可降低乳腺癌的化疗敏感性，进而增加了乳腺癌治疗后的复发率。ANGPTL4蛋白水解后的片段与整合素β结合后，能激活相关通路以减弱细胞间的相关联系，造成血管内皮细胞屏障功能障碍，进而利于肿瘤细胞对血管的附着和侵蚀，增强血管通透性，促进肿瘤的发生、发展[12-15]。

本研究结果显示，宫颈癌组织中Foxm1和ANGPTL 4蛋白阳性表达率为63.89%和75.00%，明显高于对照组（P＜0.05）。上述结果中表明宫颈癌患者Foxm1和ANGPTL4蛋白的高表达。Foxm1的促癌机制主要分为以下几点[16-18]：（1）Foxm1可促进环氧化酶2的高表达；（2）细胞周期紊乱是肿瘤的重要特征，而Foxm1能够对细胞周期进行调控；（3）Foxm1能够促进血管内皮生长因子的高表达，该机制在胃癌的发生、发展过程中已经得到了证实；（4）Foxm1还可能通过DNA复制障碍等相关机制促进细胞恶变。ANGPTL水解后形成cANGPTL4，其首先与细胞外基质作用，抑制内皮细胞粘附并调控肌动蛋白骨架，进而促进肿瘤滋养血管生成及内皮细胞迁移，有利于细胞的生长、转移及侵袭。

本研究Foxm1、ANGPTL4蛋白表达与宫颈癌临床病理特征的关系结果显示，FIGO分期Ⅱ期、肌层浸润≥1/2、中低分化宫颈癌Foxm1蛋白阳性表达率分别为89.47%、84.62%和79.07%，明显高于Ⅰ期、肌层浸润＜1/2、高分化患者；有脉管浸润宫颈癌ANGPTL4蛋白阳性表达率为95.24%，明显高于无脉管浸润。上述结果提示宫颈癌组织中Foxm1、ANGPTL4在疾病发生发展中可能有重要作用并能够促进宫颈癌的病情发展，这可能与Foxm1能够促进病情诱导因子的表达，进而促进宫颈上皮细胞对宫颈癌组织及基底膜组织的浸润有关。此外，研究[19-20]发现ANGPTL4在结直肠癌中的高表达与肿瘤分级、浸润程度及淋巴结转移呈显著正相关关系，该结果与宫颈癌的发展、浸润及分期具有一致性。

本研究进一步发现Foxm1与ANGPTL4蛋白表达呈正相关，该结果再次证实Foxm1与ANGPTL4蛋白具有密切联系，两者共同促进宫颈癌的发生、发展，但两者相互作用的具体机制尚不明晰，还需要进一步研究探讨。此外，可能宫颈癌患者自身还存在一定的特异性，关于Foxm1与ANGPTL4蛋白的具体机制尚需要足够样本量研究，以提高研究数据的准确性和科学性。综上所述，宫颈癌组织中Foxm1、ANGPTL4蛋白呈高表达，在疾病发生发展中可能有重要作用。