ITSN1 mRNA预测乳腺癌预后的价值

张莹华，马勇杰

（天津医科大学肿瘤医院肿瘤细胞生物学实验室，国家肿瘤临床医学研究中心，乳腺癌防治教育部重点实验室，天津市“肿瘤防治”重点实验室，天津市恶性肿瘤临床医学研究中心，天津300060）

乳腺癌是女性发病率最高且异质性很强的恶性肿瘤，严重威胁着女性的身心健康[1]。因此探究与乳腺癌预后相关的基因将对其治疗有很大意义。Intersectin1（ITSN1）是一种细胞衔接蛋白，主要参与网格蛋白介导的内吞、肌动蛋白细胞骨架重排、细胞信号传导等生物学过程[2]。除此之外，ITSN1还参与多种疾病的发生发展。研究表明，敲低ITSN1-S可促进肺内皮细胞的增殖[3-4]。ITSN1参与神经母细胞瘤和胶质母细胞瘤的发生发展[5-6]。ITSN1在唐氏综合征、阿尔茨海默病和亨廷顿病中异常表达[7]。然而，目前关于ITSN1在乳腺癌中的研究较少，仅有两篇文章报道ITSN1在乳腺癌中的作用，其中也不涉及ITSN1在乳腺癌各亚型中的研究。2015年的一项研究首次报道ITSN1和ITSN2存在于乳腺癌细胞的侵袭性突起中，并且与WIP相互作用，这可能有助于侵袭性伪足的形成，促进细胞侵袭和转移[8]。2017年，有研究发现CR16和ITSN1在乳腺癌细胞中相互作用，可以增加ITSN1与F-肌动蛋白丝的结合，这可能在肌动蛋白细胞骨架重塑和细胞侵袭中发挥重要作用[9]。以上结果表明，ITSN1在乳腺癌中可能主要通过调控细胞骨架重塑和细胞侵袭/转移影响细胞存活，对于ITSN1在其中发挥的具体功能还不是很清楚。为此，本研究利用数据库预测ITSN1对乳腺癌患者预后的影响，期望能够进一步阐明ITSN1在乳腺癌中可能发挥的功能。

1 材料与方法

1.1 Kaplan-Meier Plotter数据库 Kaplan-Meier Plotter数据库（http://kmplot.com/analysis/）包含了乳腺癌样本基因mRNA表达水平的数据及样本来源病例的临床预后相关信息。运用此数据库，笔者分析了ITSN1 mRNA表达水平与乳腺癌患者预后的关系，所用探针ID为35776-at。对3 955例患者进行无复发生存（recurrence free survival，RFS）分析，1 402 例患者进行总生存（overall survival，OS）分析，这些样本来源于该数据库中保存的33个GSE，E-MTAB-365和E-TABM-43。总生存期定义为从疾病确诊日期到最后一次随访日期或患者死于乳腺癌的日期，无复发生存期定义为从开始用药到乳腺癌患者最早出现局部复发、远处转移或者死亡的时间。病例根据ITSN1 mRNA中位表达水平分成高表达组和低表达组，分别比较两组乳腺癌患者预后的情况。ITSN1 mRNA的中位表达水平为635，高表达组为2 908，低表达组为108。运用COX回归分析方法计算两组病例之间的预后风险比（hazard rations，HRs）和95%置信区间，同时计算log-rank P值，P＜0.05认为有统计学差异。

进行总生存分析的乳腺癌病例（n=1 402）来自以下数据库：E-MTAB-365（n=537），E-TABM-43（n=37），GSE11121（n=200），GSE12093 （n=136），GSE12276（n=204），GSE1456（n=159），GSE16391（n=55），GSE16446 （n=120），GSE16716 （n=47），GSE17705（n=196），GSE17907（n=54），GSE18728（n=61），GSE19615 （n=115），GSE20194 （n=45），GSE20271（n=96），GSE2034（n=286），GSE20685（n=327），GSE20711 （n=90），GSE21653 （n=240），GSE2603（n=99），GSE26971（n=276），GSE2990（n=102），GSE31448 （n=71），GSE31519 （n=67），GSE32646（n=115），GSE3494（n=251），GSE37946（n=41），GSE41998（n=279），GSE42568（n=121），GSE45255（n=139），GSE4611（n=153），GSE5327（n=58），GSE6532（n=82），GSE7390（n=198），GSE9195（n=77）。

进行无复发生存分析的病例（n=3 955）来以下自数据库：E-MTAB-365（n=537），E-TABM-43（n=37），GSE11121 （n=200），GSE12093 （n=136），GSE12276（n=204），GSE1456（n=159），GSE16391（n=55），GSE16446 （n=120），GSE16716 （n=47），GSE17705（n=196），GSE17907（n=54），GSE18728（n=61），GSE19615 （n=115），GSE20194 （n=45），GSE20271 （n=96），GSE2034 （n=286），GSE20685（n=327），GSE20711 （n=90），GSE21653 （n=240），GSE2603 （n=99），GSE26971 （n=276），GSE2990（n=102），GSE31448 （n=71），GSE31519 （n=67），GSE32646（n=115），GSE3494（n=251），GSE37946（n=41），GSE41998 （n=279），GSE42568 （n=121），GSE45255 （n=139），GSE4611 （n=153），GSE5327（n=58），GSE6532（n=82），GSE7390（n=198），GSE9195（n=77）。

1.2 GEPIA（Gene Expression Profiling Interactive Analysis）数据库 GEPIA数据库(http://gepia.cancer-pku.cn/)包含的内容很丰富，可寻找差异基因和相似基因，分析肿瘤病人的生存情况，探索两个基因在肿瘤及正常组织中的表达相关性。利用该数据库，笔者分析了基因ITSN1和HER2在乳腺癌中的表达情况。该数据库中保存了TCGA和GTEx两个数据库的样本信息，本研究利用其中的1 085例乳腺癌患者和291例正常对照组进行分析。

2 结果

2.1 ITSN1 mRNA表达水平与乳腺癌患者总人群预后的关系 首先，通过Kaplan-Meier Plotter数据库分析发现ITSN1 mRNA高表达的乳腺癌患者具有更好的（P=1.3e-07）无复发生存（图 1B），但不影响患者（P=0.44）的总生存（图1A）。

图1 ITSN1 mRNA表达水平与乳腺癌患者总人群OS、RFS的关系Fig 1 Relationship between ITSN1 mRNA expression level and OS,RFS in breast cancer patients

2.2 ITSN1 mRNA表达水平与不同HER2状态乳腺癌患者预后的关系 根据不同HER2状态对乳腺癌患者分类，ITSN1mRNA的表达量主要影响患者的无复发生存。ITSN1mRNA的低表达提示HER2阳性（P=0.007 2）乳腺癌患者更好的无复发生存（图2C），ITSN1mRNA的高表达提示HER2阴性（P=9e-05）乳腺癌患者更好的无复发生存（图2D）。但无法预测患者的总生存，HER2阳性（P=0.69），HER2 阴性（P=0.14）（图2A、2B）。

图2 ITSN1mRNA表达水平与不同HER2状态乳腺癌患者预后的关系Fig 2 Relationship between ITSN1 mRNA expression level and prognosis of breast cancer patients in different HER2 status

2.3 ITSN1 mRNA表达水平与各亚型乳腺癌患者预后的关系 进一步分析看到，ITSN1 mRNA的低表达预示Her-2扩增型乳腺癌（P=0.008 5）更好的总生存（图 3 C），而在 luminal A（P=0.17），luminal B（P=0.49），基底细胞型（P=0.24）乳腺癌中没有这种预测价值（图3 A、3 B、3 D）。

图3 ITSN1 mRNA表达水平与各亚型乳腺癌患者OS的关系Fig 3 Relationship between ITSN1 mRNA expression level and OS of breast cancer patients

ITSN1 mRNA的表达水平与乳腺癌患者的无复发生存有一定关系。ITSN1 mRNA的高表达预示luminal A（P=0.000 46），luminal B（P=5.7e-05）乳腺癌患者更好的无复发生存（图4 A，4 B），而在Her-2扩增（P=0.12），基底细胞型（P=0.64）乳腺癌中没有这种预测价值（4 C、4 D）。

图4 ITSN1 mRNA表达水平与各亚型乳腺癌患者RFS的关系Fig 4 Relationship between ITSN1 mRNA expression level and RFS in breast cancer patients

2.4 ITSN1 mRNA表达水平与不同淋巴结状态乳腺癌患者预后的关系 根据淋巴结转移的情况对乳腺癌患者分类，笔者发现ITSN1 mRNA的高表达提示淋巴结阴性（P=0.003 4）乳腺癌更好的总生存（图5B），淋巴结阳性（P=0.045）乳腺癌更好的无复发生存（图5 C）。但无法预测淋巴结阳性患者的总生存（P=0.93）（图5 A）和淋巴结阴性患者的无复发生存（P=0.45）（图5 D）。

图5 ITSN1mRNA表达水平与不同淋巴结状态乳腺癌患者预后的关系Fig 5 Relationship between ITSN1 mRNA expression level and prognosisof breast cancer patients in different lymph node status

2.5 基因ITSN1和HER2在肿瘤中的表达情况 ITSN1 mRNA的低表达在HER2阳性/扩增型乳腺癌患者中提示更好的预后，而在其他患者中ITSN1 mRNA的高表达提示更好的预后，这说明HER2在ITSN1 mRNA预测乳腺癌预后方面发挥重要作用。为此笔者分别比较了基因ITSN1和HER2在多种癌症中的表达。两种基因在数十种癌症中的表达既有升高也有降低，HER2在乳腺癌中的表达升高，ITSN1在乳腺癌中的表达降低（图6 A、6 B）。这提示ITSN1在不同肿瘤中可能具有不同的功能，与肿瘤的发生发展密切相关。

在乳腺癌（BRCA）中，通过对1 085例乳腺癌患者和291例正常对照组分析，箱式图分析结果发现HER2基因的表达高于正常乳腺组织（图6C），ITSN1基因的表达低于正常乳腺组织（图6 D），差异均有统计学意义。

图6 基因HER2和ITSN1在多种肿瘤及对应正常组织中的表达(A,B)，两种基因在乳腺癌及正常乳腺组织中表达的箱式图（C,D）Fig 6 Expression of genes HER2 and ITSN1 in various tumors and corresponding normal tissues(A,B),box plots of expression of two genes in breast cancer and normal breast tissues(C,D)

3 讨论

ITSN与调控细胞凋亡的线粒体途径，促进生存的PI3K途径，调节细胞生长、分化和发育的RTK、Ras、MAPK途径等密切相关，这些信号通路的改变都将严重影响细胞发挥正常的功能，更有可能导致各种疾病的发生。研究表明，过表达ITSN1可以促进成纤维细胞的恶性转化[10]。

HER2基因在多种癌症中扩增，包括乳腺癌。HER2是重要的乳腺癌预后判断因子，据报道，大约15%～25%的患者为HER2阳性乳腺癌[11-12]。cBioPortal数据库中的Network板块显示，HER2基因在乳腺癌中的扩增频率为22.8%，这与文献报道一致。

笔者发现ITSN1 mRNA的高表达预示乳腺癌总人群更好的预后，然而，ITSN1 mRNA的低表达却能够提示Her-2扩增型乳腺癌患者更长的总生存，HER2阳性乳腺癌患者更长的无复发生存。对于这种现象，笔者提出了以下几点猜想：HER2可以通过PI3K-AKT通路间接活化NF-kB，阻断乳腺癌细胞的凋亡，促进细胞生存[13]。另外，PI3K/AKT通路在HER2阳性乳腺癌中过度激活，这可能引起了患者总生存时间短及抗HER2治疗耐药[14]。ITSN1对PI3KAKT途径具有调节作用，ITSN1与PI3K-C2β发生相互作用形成复合物，促进AKT的磷酸化并激活下游信号通路，促进细胞生存[15]。有研究报道，ITSN1与PI3KC2β在神经母细胞瘤中相互作用，沉默ITSN1可降低细胞生长，过表达PI3K-C2β可逆转ITSN1沉默导致的细胞生长减慢[16-17]。

HER2与ITSN1存在相互作用并参与药物反应，这可能对肿瘤患者的生存及化疗效果产生重要的影响。总之，HER2与ITSN1都可以调节PI3K/AKT通路，该通路与细胞增殖、生长、迁移和代谢等多个过程密切关联。至于两者如何通过调节PI3K/AKT或其他信号通路而影响乳腺癌细胞的存活，具体作用机制有待于深入研究和验证。

笔者进一步通过GEPIA数据库分析，发现基因ITSN1和HER2在多种癌症中异常表达，而在乳腺癌中，HER2基因的表达高于正常组织的2.34倍，ITSN1基因的表达低于正常组织的2.34倍。通过对1 085例乳腺癌患者和291例正常对照组的分析，我们发现ITSN1在乳腺癌中的表达明显低于正常乳腺组织，HER2在乳腺癌中的表达显著高于正常乳腺组织。

本研究首次利用Kaplan-Meier Plotter数据库在线分析了ITSN1 mRNA的表达量对乳腺癌患者预后的影响，我们发现ITSN1 mRNA的高表达能够提示乳腺癌总人群更长的无复发生存（P=1.3e-07），但不影响患者的总生存（P=0.44）。进一步将乳腺癌患者分类，发现ITSN1 mRNA高表达的luminal A（P=0.000 46），luminal B（P=5.7e-05），HER2 阴性（P=9e-05），淋巴结阳性（P=0.045）乳腺癌患者具有更长的无复发生存时间，高表达ITSN1 mRNA的淋巴结阴性（P=0.0034）乳腺癌患者具有更好的总生存。

总体来说，笔者发现单一考虑ITSN1 mRNA的表达，高表达组患者的预后好于低表达组。如果患者同时被鉴定为HER2阳性/扩增型乳腺癌，那么他的预后实际上差于低表达组。因此，笔者提出综合考虑ITSN1和HER2评价乳腺癌患者预后的观点，为精准预测和精准治疗提供新的可参考的理论依据。