基于NF-κB通路探讨鹿角壮骨胶囊对兔膝骨关节炎的保护作用机制

梁子聪 王恒 胡建山 陆瑞娜 胡先运

(1黔南民族医学高等专科学校，贵州 都匀 558000；2黔南州中医医院；3黔南州人民医院；4贵州医科大学天然产物化学重点实验室)

骨关节炎(OA) 是中老年人常见的致残性疾病之一，全身各关节均可发病，其中膝关节发病率最高〔1〕。目前我国膝骨关节炎(KOA) 总体发病率约为18%，女性(约19%)高于男性(约11%)〔2〕。KOA的病因病机复杂，有研究显示，KOA的发病与核因子(NF)-κB信号通路的激活关系密切，它通过转导细胞外信号，调节多种基因表达，参与了KOA发病的免疫应答与炎症反应、滑膜成纤维细胞增生、软骨细胞外基质降解、软骨细胞凋亡等多个环节〔3，4〕。KOA的早期治疗以抗炎、镇痛为主，但长期服用非甾体类抗炎药会带来诸多不良反应〔5〕。中医药治疗KOA的疗效良好，副作用少，具有广阔的开发前景。黔南州中医医院研制的院内制剂鹿角壮骨胶囊，用于治疗因肝肾不足引起的KOA已获得不错的临床效果〔6〕。本实验旨在观察鹿角壮骨胶囊对NF-κB通路的影响，了解其对KOA的治疗作用机制。

1 材料与方法

1.1仪器 JA10002型电子天平(上海精天)；DDIL-5型恒温箱(上海安亭)；ASP300 S型全封闭式组织脱水机、RM2265型全自动轮转式切片机、HI1210型摊片机、DM750型光学显微镜(德国Leica)；GelDoc型凝胶成像系统(美国BIO-RAD)。

1.2药品与试剂 治疗药物鹿角壮骨胶囊由黔南州中医医院制剂科提供(批准文号：黔药制2013003号，规格：0.45 g/粒)，木瓜蛋白酶(北京索莱宝)，封闭液(武汉博士德)，血管内皮生长因子(VEGF)、低氧诱导因子(HIF)-2α、NF-κB抑制蛋白(IκBα)、NF-κB p65、骨桥蛋白(OPN)一抗，通用型SP试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)显色盒(北京中杉金桥)，4%多聚甲醛、二甲苯、乙醇、乙二胺四乙酸(EDTA)脱钙液由黔南州人民医院病理科提供，其余试剂均为国产分析纯。

1.3实验动物与分组 普通级四月龄日本长耳白雌兔24只，体重(2.0±0.5)kg，由长沙天勤生物技术有限公司提供，许可证号：SCXK(湘)2014-0010。适应性饲养1 w，分笼饲养，不限制饮食。24只兔随机分为3组，分别为正常组、模型组、治疗组(鹿角壮骨胶囊)，每组8只。

1.4造模 各组兔按3.5 ml/kg腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉，待完全麻醉后，剪刀于右侧膝关节内侧附近备皮，显露皮肤，碘伏、75%酒精棉签反复消毒。1 ml注射器抽取提前配制好的4%木瓜蛋白酶溶液0.5 ml，微微弯曲膝关节，针尖分别在模型组与治疗组兔内侧膝眼进针，回抽确定进入关节腔后，缓慢注射，棉签轻压针眼，避免溶液溢出。正常组同法注射等体积灭菌注射用水。各组被动屈伸右侧膝关节20次，促进溶液在关节腔内均匀扩散。间隔3 d重复一次，共注射3次。末次注射后，各组兔每天驱赶运动30 min，其余时间笼内自由活动。

1.5治疗方法 首次注射后第2周，治疗组给予鹿角壮骨胶囊药粉0.3 g/kg(参照成人和实验动物等效剂量〔7〕换算而得)，称取体重的相应剂量，用蒸馏水稀释成10 ml后灌胃，每天1次，连续给药4 w。余组给予10 ml蒸馏水灌胃。

1.6动物取材 末次给药第2天，麻醉处死所有实验动物。切开关节囊，剔除软组织，取下膝关节及滑膜标本，膝关节标本置于4%多聚甲醛中固定，滑膜组织置于液氮冷冻保存。

1.7观察指标

1.7.1各组兔膝关节滑膜IκBα、NF-κB p65、OPN蛋白表达的检测 采用Western印迹法检测各组兔膝关节滑膜组织IkBα、NF-κB p65、OPN蛋白表达的情况。将滑膜标本剪成约1 mm×1 mm×1 mm大小，细胞裂解法提取总蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度，收集上清液，提取等量蛋白，配置十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)后转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，封闭，加入IκBα(1∶1 000)、NF-κB p65(1∶1 000)、OPN(1∶500)、β-actin(1∶2 000)一抗，4℃室温摇床过夜，37℃复温后加二抗(1∶1 000)孵育2 h，TBST漂洗，电化学发光(ECL)显色，用β-actin做内参，Image J软件计算条带灰度值(目的蛋白相对含量=目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值)。

1.7.2各组兔膝关节软骨VEGF、HIF-2α、NF-κB p65阳性表达的检测 采用免疫组化法(SP)检测各组兔软骨组织VEGF、HIF-2α、NF-κB p65阳性表达的情况。按照免疫组化检测试剂说明书操作：石蜡切片经60℃烘片1 h，入二甲苯脱蜡2次，每次10 min、梯度酒精(100% 3 min，90% 3 min，85% 3 min，75% 3 min，蒸馏水3 min，PBS 3 min)。将切片置于0.1 mol/L且pH=6.0的枸橼酸液修复液中，用微波炉100火力3 min至微微沸腾，再用50火力维持7 min，停止加热后自然冷却20～30 min。用磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗5 min×3次。3%过氧化氢(H2O2)孵育10 min以消除内源性过氧化物酶活性。PBS冲洗，5 min×3次。滴加封闭液〔5%牛血清白蛋白(BSA)〕，在湿盒中室温30 min。用滤纸擦去封闭液，勿洗。滴加适宜浓度的一抗置湿盒中4℃孵育过夜(稀释浓度：VEGF为1∶100，NF-κB p65为1∶150，HIF-2α为1∶200)，再用PBS 5 min×3次洗去一抗，用滤纸擦去标本外的PBS。滴加生物素化二抗工作液，室温置湿盒中孵育20 min，用PBS 5 min×3次洗去二抗，用滤纸擦去标本外的PBS。滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，室温置湿盒中孵育20 min，用PBS 5 min×3次洗去，用滤纸擦去标本外的PBS。DAB显色剂显色，自来水充分冲洗。再进行苏木素复染，脱水，透明，中性树胶封片。每张组织切片在相同部位摄取3个视野(×400)。运用Image-Pro Plus 6.0专业图像分析软件对图片进行分析，计算相同面积内相关指标阳性表达的平均光密度值(平均光密度值=光密度值÷测量面积)。

1.8统计学处理 使用SPSS22.0软件进行统计学处理。采用Shapiro-Wilk法作正态检测，Levene法作方差检测。多组间比较采用单因素方差分析，两两比较若方差齐性采用LSD-t检验，方差不齐则采用Dunnet-t检验。

2 结 果

2.1各组兔膝关节滑膜IκBα、NF-κB p65、OPN蛋白表达的比较 与正常组比较，模型组兔膝关节滑膜IκBα、NF-κB p65、OPN的蛋白相对表达量明显升高(P<0.05)；与模型组比较，治疗组IκBα、NF-κB p65、OPN的蛋白相对表达量明显降低(P<0.05)。见图1、表1。

图1 Western印迹法检测各组兔滑膜中IκBα、NF-κB p65、OPN蛋白表达

组别IκBα/β-actinNF-κB p65/β-actinOPN/β-actin正常组29.83±7.8140.59±5.2636.38±2.24模型组111.01±20.281)116.22±15.611)146.06±27.781)治疗组77.45±18.281)2)74.97±10.711)2)92.69±7.891)2)

与正常组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05；表2同

2.2各组兔膝关节软骨VEGF、HIF-2α、NF-κB p65阳性表达的比较 与正常组比较，模型组兔膝关节软骨VEGF、HIF-2α、NF-κB p65的表达明显升高(P<0.05)；与模型组比较，治疗组VEGF、HIF-2α、NF-κB p65的表达明显降低(P<0.05)。见表2、图2。

图2 各组兔软骨VEGF、HIF-2α和NF-κB p65免疫组化阳性表达(IHC，×100)

表2 各组兔软骨VEGF、HIF-2α和NF-κB p65免疫组化表达结果比较

3 讨 论

KOA 是一种慢性进行性退行性疾病，病理过程包括了滑膜炎性增生、软骨退变、骨赘形成等多个方面〔8〕。NF-κB可与多种基因的启动子或增强子结合促进基因转录，是免疫与炎症反应中的重要转录因子之一。相关研究表明，NF-κB蛋白家族存在于OA患者的多种细胞中，在滑膜组织、软骨及软骨下骨、关节液及周围肌肉中均出现高表达〔9〕。NF-κB几乎参与了OA发病的所有病理过程，因此通过抑制NF-κB途径干预OA的发展，成为研究该疾病治疗方法的新方向。正常情况下，胞内NF-κB二聚体(包括p65和p50两组蛋白)被IκB隔离在细胞质中。当NF-κB通路被上游信号介导的分子激活时，IκB被磷酸化导致蛋白酶体降解，NF-κB蛋白被释放，介导信号向细胞核内传导。随后，p65被磷酸化进入细胞核，进而促进或抑制特定基因的表达〔10，11〕。研究显示，当NF-κB信号通路被激活时，可以快速诱导表达免疫和炎症反应多个相关基因，其中包括细胞因子〔白细胞介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-17、环氧酶(COX)-2〕、基质金属蛋白酶(MMPs)等，促进炎症反应形成〔12〕。IL-1β、TNF-α、IL-17是OA发病的密切相关细胞因子，除了能刺激成纤维细胞增生外，还能促进软骨细胞凋亡〔13〕。MMPs是降解细胞外基质的主要蛋白酶，MMPs表达增多时，软骨细胞外基质将遭受进行性降解而被破坏〔14〕。

OPN作为细胞免疫的早期活化因子，可激活NF-κB信号通路，参与OA的发生、发展〔15〕。有研究报道，OPN在OA重度骨赘中出现高表达，并且表达量与OA的X线分期严重程度呈正相关，提示OPN可能在OA软骨破坏、骨质增生过程中发挥重要作用〔16〕。敲除大鼠OPN后，其炎症介质、细胞因子的生成被抑制，作用与NF-κB抑制剂相似〔17〕。OA促使软骨中HIF-2α的表达增加，导致软骨分解和软骨内骨形成〔18〕。NF-κB作为HIF-2α的上游信号，与其表达水平密切相关〔19〕。实验表明，OA小鼠软骨细胞中HIF-2α水平的提高将加重关节软骨细胞的凋亡，增强了Epas1和Fas基因的表达及软骨的损伤，HIF-2α的高表达还可以诱导软骨骨化，导致关节中心的软骨退化并在软骨边缘形成骨赘〔20〕。HIF-2α还可通过上调靶基因促进VEGF的表达，加速OA的病变进程。VEGF参与了OA血管翳的形成，血管生成过程中可促进炎症因子的释放和感觉神经的生长，导致OA关节疼痛和肿胀加重〔21〕。Ludin等〔22〕用VEGF注射液在正常小鼠关节腔内注射，每周1次，数周后该关节出现骨赘形成，说明VEGF与OA骨赘形成相关。本实验结果表明，与正常组比较，模型组兔膝关节滑膜中IκBα、NF-κB p65、OPN的蛋白相对表达量明显升高，软骨中VEGF、HIF-2α、NF-κB p65的表达明显升高，说明木瓜蛋白酶膝关节腔内注射可通过激活NF-κB信号通路诱导OA模型建立。与模型组比较，治疗组关节滑膜中IκBα、NF-κB p65、OPN的蛋白相对表达量明显降低，关节软骨中VEGF、HIF-2α、NF-κB的表达明显降低，说明鹿角壮骨胶囊可能通过抑制NF-κB信号通路的激活发挥对OA的保护作用。

综上所述，鹿角壮骨胶囊可通过抑制NF-κB信号通路的激活而发挥缓解KOA的作用。KOA的发病是多种炎症介质诱导的结果，而NF-κB信号通路是其中的主要通路之一。鹿角壮骨胶囊还可能存在多通路相互作用，尚待进一步研究了解。