茶树叶片蛋白双向电泳体系建立与应用

周 琳，申加枝，段 玉，王 婷，王玉花，朱旭君，马媛春，房婉萍

(1.南京农业大学茶叶科学研究所, 江苏 南京 210095；2.上海市农业科学院林木果树研究所, 上海 201403)

蛋白质组学技术是深入研究植物响应逆境胁迫的重要工具之一[1]，随着技术的不断发展和成熟，其在植物逆境胁迫研究上的应用也越来越深入和广泛。虽然，近年来蛋白质组学中同位素标记相对和绝对定量技术(iTRAQ)在动植物研究中备受关注，但双向凝胶电泳技术(Two-Dimensional Gel Electrophoresis，2-DE)作为蛋白质组学的常用技术之一，在动物、植物和微生物等研究领域的应用仍较为广泛[2]。蛋白双向电泳体系因其准确度、灵敏度和可重复性较好，对于不同物种逆境胁迫下差异蛋白的筛选和分析具有重要意义。因此，蛋白双向电泳体系作为基础，其建立及优化一直备受关注[1,3—5]。

茶树Camellia sinensis 为山茶科山茶属多年生常绿经济作物，喜温暖湿润气候。近年来，春季的“霜冻”和“倒春寒”低温灾害及夏秋季的高温、干旱和强光等灾害，显著降低了茶叶的产量和品质[6—7]。利用2-DE 技术开展低温、干旱等逆境胁迫下差异蛋白分析，可为深入研究茶树对逆境胁迫的响应机理奠定基础。近年来，茶树2-DE 体系的建立和优化备受关注，包括蛋白样品制备[8]、不同组织的体系建立[9—10]，以及逆境胁迫的差异蛋白分析[11]。目前，不同研究使用的茶树品种不同，包括‘安徽一号’[8]、‘毛蟹’[10]、‘铁观音’[11]等。近年来，国家级茶树良种‘迎霜’因其较强的抗性而备受欢迎，也是较好的试材。虽然任燕等[9]以‘迎霜’雌蕊为材料，建立其总蛋白质分离双向电泳体系，但该品种叶片2-DE 体系构建尚未有报道。

对于不同的物种、组织和处理条件，其蛋白质组分和理化成分不同[1—3,8—11]。因此，2-DE 没有统一的广谱体系，必须根据材料和具体处理方法，筛选合适的蛋白提取和双向电泳条件。本研究以茶树品种‘迎霜’的一芽二、三叶为材料，筛选提取方法，对双向电泳的IPG 胶条选择、上样量、分离胶浓度、染色方法进行条件优化，建立适于‘迎霜’叶片的2-DE 体系，并应用于低温和干旱胁迫下差异蛋白初步分离，为‘迎霜’茶苗在逆境胁迫下蛋白表达差异的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

实验于2011 年10 月至2012 年3 月开展，以南京农业大学茶叶科学研究所栽培的一年生‘迎霜’和‘安吉白茶’茶苗为材料，栽培方法参照李磊等[12]，取健壮植株的一芽二、三叶，称重后，迅速放入液氮，立即贮存于-80 ℃冰箱用于2-DE 体系建立。另取4 ℃低温处理和聚乙二醇6000(PEG 6000)模拟干旱胁迫处理12 h 的‘迎霜’一芽二、三叶片，用于2-DE 体系的验证和应用。

1.2 方法

1.2.1 茶树叶片蛋白提取 蛋白提取方法分别使用TCA-丙酮沉淀法和改良Tris-HCl 抽提法。TCA-丙酮沉淀法操作步骤参照郭春芳等[11]提取‘铁观音’叶片的方法。参照李勤等[8]、谷瑞升等[13]的改良Tris-HCl抽提法，并对部分试剂用量和操作时间进行改良，研磨时添加交联聚乙烯吡咯烷酮(PVPP) 0.3 g；4 ℃温控摇床震荡浸提1.5 h；冷丙酮和80%冷丙酮洗涤各3 次。两种提取方法均采用低温真空冷冻干燥，随后置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.2 蛋白质沉淀的溶解和含量测定 蛋白质沉淀的溶解参照任燕等[9]方法；蛋白质含量测定采用Bradford 法[14]。

1.2.3 蛋白双向电泳

1.2.3.1 第一向等电聚焦(IEF) 第一向等电聚焦使用设备和操作步骤参照任燕等[9]方法，针对叶片的特征，调整等电聚焦程序，具体程序见表1。使用17 cm (pH 4～7)线性胶条(上样量为1.6 mg)，比较2 种蛋白质提取方法的提取效果；利用TCA-丙酮法提取的蛋白质，使用17 cm 的pH 3～10、4～7 和5～8胶条(上样量为1.6 mg)，比较不同pH 范围胶条的蛋白质分离效果；使用17 cm (pH 4～7)线性胶条比较不同上样量(1.0、1.6、1.8 和2.2 mg)的分离效果。

1.2.3.2 IPG 胶条的平衡和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

IPG 胶条的平衡、聚丙烯酰胺凝胶配制和电泳，使用的试剂、设备以及操作步骤均参照任燕等[9]的方法，并比较不同SDS-PAGE 胶浓度(12.5%、13.5%)对蛋白质分离的效果。

表1 等电聚焦电泳程序Table 1 Isoelectric focusing (IEF) procedure

1.2.4 染色方法 参考Blue-silver 法[14]和Wang 等[15]高敏考马斯亮蓝R-250 染色法。

1.2.5 凝胶扫描和分析 使用Bio-Rad-GS800 扫描仪进行图像采集，利用PDQuest 8.0.1 软件进行2-DE图谱分析，使用Excel 2007 和SPSS 16.0 对不同处理的蛋白点数量进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 提取方法对2-DE 的影响

TCA-丙酮沉淀法和改良Tris-HCl 法提取蛋白质的得率分别为40.56±0.53 mg·g-1、10.87±0.66 mg·g-1，可见TCA-丙酮沉淀法获得的蛋白量较多。2 种提取方法获得的蛋白质的双向电泳图谱如图1 所示。上样量为1.6 mg时，相同电泳条件下， TCA-丙酮沉淀法、改良Tris-HCl 法分别获得778±23 个、835±19 个蛋白点，改良Tris-HCl 法获得的蛋白点数略高于TCA-丙酮沉淀法；Tris-HCl 法提取的蛋白双向电泳效果更好，获得的蛋白点形状规则，背景清晰，更适用于差异蛋白的分析。由此可见，采用TCA-丙酮沉淀法和Tris-HCl 法均可进行茶苗叶片总蛋白的提取，但为便于建立茶树叶片蛋白双向电泳体系，本实验后期蛋白提取方法采用TCA-丙酮法，以方便多次重复。

2.2 IPG 胶条pH 范围对2-DE 的影响

由图2 可见，IPG 胶条pH 为3～10 时，茶树叶片蛋白质大部分集中在pH 3～8 之间；pH 3～4 之间的蛋白质点高度集中且存在重叠，使得大部分蛋白质点不能有效区分，极大影响2-DE 的分辨率。采用pH 5～8 的IPG 胶条，蛋白在pH 5～6 内的堆积不利于分离；同时与pH 3～10 的胶条一样，在pH≥8 处蛋白点较少。在IPG 预制胶条pH 范围为4～7 时，集中在pH 5～7 之间蛋白质点得到了有效分离，明显提高了双向电泳的分辨率(图2: B)。因此，在不改变胶条长度情况下，选择pH 4～7 的IPG 胶条能使茶树叶片中大量蛋白质得到有效分离，且分辨率较高，利于后续分析。

图1 不同提取方法对茶树叶片蛋白双向电泳的影响Fig. 1 Effects of different extraction methods on 2-DE maps of leaf protein A. TCA-丙酮沉淀法；B. 改良Tris-HCl 提取法

图2 IPG 胶条pH 范围对茶树叶片蛋白双向电泳的影响Fig. 2 Effects of different pH gradients of IPG strip on 2-DE maps of leaf protein A. pH 3～10；B. pH 4～7；C. pH 5～8

2.3 上样量对2-DE 的影响

为获取最佳蛋白上样量，以TCA-丙酮法提取的‘迎霜’叶片蛋白干粉为材料，选择17 cm pH 4～7 IPG胶条，分别用1.0、1.6、1.8 和2.2 mg 上样量进行双向电泳。利用PDQuest 8.0.1 软件分析后，4 个不同上样量处理的2-DE 图谱中，检测到的蛋白点分别为516±19 个、789±21 个、1069±17 个和1286±29 个(图 3)。由图3: A 可见，上样量为1.0 mg 时，图谱中有效蛋白点数少且分辨率较低；上样量为1.6、1.8 和2.2 mg 时(图3: B,C,D)，随着上样量的增加，图谱中蛋白质点也随着增加，图谱中有效蛋白点数较多，且能有效分离。因此，‘迎霜’叶片蛋白双向电泳适宜的上样量在1.6～2.2 mg 间。

2.4 分离胶浓度对2-DE 的影响

如图4 所示，上样量为1.6 mg，SDS-PAGE 胶浓度为12.5%时，2-DE 图谱上茶苗叶片蛋白点分离不够清晰，胶中上部的蛋白质点可有效分离，而胶下部的蛋白质点则重叠，总蛋白质整体分离效果欠佳；当浓度为13.5%时，小分子蛋白充分分离，且蛋白点均匀分布在整个胶面内，背景清晰，没有重叠的蛋白点，表明分离‘迎霜’茶苗叶片蛋白分离胶的适宜浓度为13.5%。

图3 上样量对茶树叶片蛋白双向电泳的影响Fig. 3 Effects of sample loading on 2-DE maps of leaf protein A.1.0 mg；B.1.6 mg；C.1.8 mg；D. 2.2 mg

图4 分离胶浓度对茶树叶片蛋白双向电泳的影响Fig. 4 Effects of different gels on 2-DE maps of leaf protein A.12.5%分离胶；B.13.5%分离胶

2.5 染色方法对2-DE 的影响

由于上样量为1.6 mg，不宜使用银染法，因此比较两种考马斯亮蓝染色法(Blue-silver 法、高敏考马斯亮蓝R-250 法)对双向电泳效果的影响。染色后，高敏考马斯亮蓝R-250 法总点数为809±15 个，Blue-silver 法总点数为677±21 个；高敏考马斯亮蓝R-250 法总体背景较清晰，分辨率高，且获得蛋白质点的数量显著高于Blue-silver 法(图5)。可见，高敏考马斯亮蓝R-250 法比Blue-silver 法更适合于‘迎霜’叶片蛋白质的染色。

2.6 2-DE 体系的应用

基于前期体系的建立，采用Tris-HCl 法提取‘迎霜’和‘安吉白茶’茶苗叶片总蛋白，选用17 cm pH 4～7 IPG 胶条，使用1.6 mg 上样量、13.5%聚丙烯酰胺凝胶进行分离，最终用高敏考马斯亮蓝R-250法进行染色，‘迎霜’和‘安吉白茶’叶片分别获得819±17、878±19 个清晰的蛋白质点，表明建立的2-DE 体系适用于不同茶树品种。采用相同体系，分别对低温和干旱胁迫12 h 的‘迎霜’茶苗叶片总蛋白进行双向电泳，可分别分离到856±13 个和1129±21 个蛋白点。由图6 可见，低温和干旱胁迫处理下的叶片蛋白质点充分分离且背景清晰、分辨率高，可用于差异蛋白分析、筛选、挑取和检测。

3 结论与讨论

图5 染色方法对叶片蛋白双向电泳的影响Fig. 5 Effects of different staining methods on 2-DE maps of leaf protein A.Blue-silver 法；B.高敏考马斯亮蓝R-250 法

样品制备方法、胶条的选择、上样量、分离胶浓度以及染色方法等，均影响双向电泳的分辨率、蛋白质的分离效果、差异蛋白的筛选等，是蛋白质双向电泳的关键技术。蛋白质样本的制备是实验的第一步，由于茶树中富含次生代谢产物，且在逆境胁迫下，其可溶性物质如可溶性蛋白、可溶性糖、游离脯氨酸等含量显著增加[6—7,12]，极易影响2-DE 效果。李勤等[8]研究表明，TCA-丙酮沉淀法蛋白质提取效率较高，在本实验中该方法提取效率显著高于Tris-HCl 法；然而，也有研究表明，TCA-丙酮沉淀法极易因不能有效去除次生代谢产物和盐分，导致蛋白质点的分离受到干扰，最终获得的蛋白质点数少且横纵条纹较多[17—18]。本实验采用TCA-丙酮沉淀法和Tris-HCl 法所获得的蛋白质除了蛋白点有差异外，其他差异并不显著，且不存在横纵条纹严重等问题，这可能与物种、品种和取样部位相关。本实验使用的材料为一年生茶苗的一芽二、三叶，蛋白质提取过程中受干扰的因子少，且改良Tris-HCl 法提取时，针对茶树次生代谢产物较多，将PVPP 增加至0.3 g；为提高提取效率，4 ℃温控摇床震荡浸提时间延长至1.5 h；为降低盐分和杂质，冷丙酮和80%冷丙酮洗涤次数增加至3 次。

胶条长度、pH 范围、上样量、分离胶浓度和染色方法决定蛋白质可否有效分离以及2-DE 图像的分辨率，同时，这几项条件之间也存在着相关性。例如，胶条长度决定着上样量，上样量决定分离胶浓度和染色方法(过高上样量不适用于银染法)。因此，优化各项指标，可提高双向电泳的分辨率、准确性和重复性，有利于后续差异蛋白的筛选和质谱验证。胶条的选择，需要兼顾总蛋白质的等电点和蛋白质点的分离效果。本研究比较了17 cm 的pH 3～10、4～7 和5～8 胶条对蛋白质的分离效果，结果显示叶片蛋白集中在pH 4～7 间，与茶树品种‘毛蟹’[10]、‘铁观音’[11]研究结果一致。这可能是与植物叶片蛋白绝大多数集中在pH 4～7 间[19—20]，且碱性蛋白分离较为困难有关。上样量决定着差异蛋白分离的准确性和有效性，本研究发现，对于‘迎霜’茶苗叶片而言，上样量为1.6～2.2 mg 较为合适。与以往研究相比[8,10—11]，上样量较大，样品中盐离子浓度可能会偏高，因此调整了等电聚焦的程序。等电聚焦程序上，先在低电压下(100、200、400、600、1000 和4000 V)进行，使样品中的盐离子充分移动到胶条两极，然后在8000 V 恒定电压下聚焦。蛋白质样品在60 000Vh 的情况下能得到充分地聚焦。分离胶浓度会影响蛋白质分离的程度和清晰度，浓度过高或过低均会影响蛋白质分离效果，降低差异蛋白的筛选效率[21]。本研究比较了12.5%和13.5%分离胶的分离效果，最终选择13.5%的分离胶浓度作为最适浓度，可使蛋白得到有效分离。目前，常规银染方法虽灵敏度高且已被广泛使用，但其步骤繁琐、染色条件亦难控制，且对蛋白质质谱分析有干扰[22]；近年来大量研究中使用考马斯亮蓝染色法[23—26]，与银染法相比，其更为简便且适用于质谱分析。本研究使用高敏考马斯亮蓝R-250 染色法，获得的2-DE 图谱蛋白点较多且清晰，适于上样量1.6 mg 的叶片蛋白质。

图6 低温和干旱胁迫下叶片蛋白双向电泳Fig. 6 2-DE maps of leaf protein under cold and drought stress A.低温胁迫(4℃, 12 h)；B.干旱胁迫(PEG6000, 12 h)

本研究表明，采用TCA-丙酮法或Tris-HCl 法提取‘迎霜’叶片总蛋白，选用17 cm pH 4～7 IPG胶条，选择1.6～2.2 mg 上样量，13.5%聚丙烯酰胺凝胶进行分离，使用高敏考马斯亮蓝R-250 法进行染色，能较为有效地分离‘迎霜’茶苗叶片各分子量的蛋白，获得分辨率高、背景清晰、重复性好的双向电泳图谱，该双向电泳体系既适用于正常生长的叶片，也适用于低温和干旱胁迫的茶树叶片蛋白质双向电泳分析，可用于低温和干旱胁迫下茶树差异蛋白分析。