雷公藤组织培养技术体系建立

黄淑燕，郑郁善

(福建林业职业技术学院，福建 南平 353000)

雷公藤Tripterygium wilfordii 属于卫矛科Celastraceae 雷公藤属Tripterygium 植物，多年生落叶蔓性灌木[1]。雷公藤味苦、辛，性凉，大毒，归肝、肾经，是我国重要的有毒天然药物资源。雷公藤在中药材方面具有很大开发应用前景，但是大多数研究主要集中在活性成分鉴定、提取分离及医药应用研究等方面。目前，关于雷公藤组织培养的研究还较匮乏[2—3]。近年来，市场上对药物需求急剧增加以及生物农药供不应求，造成对天然资源的大量开采利用，使得雷公藤野生资源枯竭。由于雷公藤自然条件下生长周期较长，加上耕地面积逐年减少，仅靠人工栽培难以满足市场需求。利用组织培养技术获得雷公藤再生植株，既可以满足市场需求，又可以保护自然资源、维护生态环境，是实现雷公藤植物资源可持续利用的重要手段[4]。

1 材料与方法

1.1 材料

雷公藤由福建农林大学工业原料林研究所提供。选取雷公藤当年生、半木质化、生长健壮、无病虫害的带叶茎段为外植体。

1.2 方法

采用正交试验设计来探讨雷公藤茎段再生技术，运用方差、极差分析等分析方法进行数据处理，从而筛选最优组合。

1.2.1 芽诱导培养 以雷公藤带叶嫩茎为外植体，以MS 为基本培养基，在培养基中添加不同质量浓度6-BA (0.5、1.0、1.5 mg·L-1)、NAA (0、0.05、0.10 mg·L-1) 和IBA (0、0.05、0.10 mg·L-1) 进行芽体诱导。每处理接种外植体100 个，3 次重复。30 d 后统计芽体总数、萌芽率及增殖系数。

1.2.2 芽继代增殖培养 以芽诱导培养的雷公藤幼嫩外植体为材料，以MS 为基本培养基，在培养基中添加不同浓度6-BA (0.1、0.5、1.0 mg·L-1)、NAA(0、0.05、0.1 mg·L-1)及KT(0、0.5、1.0 mg·L-1)增殖培养。每种处理接种外植体100 个，3 次重复。30 d 后统计增殖系数和芽体生长状况。

1.2.3 壮苗培养 以继代增殖培养的雷公藤外植体为材料，以MS 为基本培养基，在培养基中添加不同浓度6-BA (0、0.5、1.0 mg·L-1)、VB1(0、0.25、0.5 mg·L-1)及蛋白胨(0.5、1.0、1.5 g·L-1)进行壮苗培养。每处理接种外植体100 个，3 次重复。30 d 后统计增殖系数和苗木长势情况。

1.2.4 生根培养 以壮苗培养后的雷公藤幼苗为材料，探讨不同含盐量基本培养基(MS、1/2MS、1/4MS)、不同质量浓度NAA (1.0、2.0、3.0 mg·L-1)、KT(0、0.1、0.5 mg·L-1)及蛋白胨(0.5、1.0、1.5 g·L-1)对生根的影响。每处理接种100 个外植体，3 次重复。培养30 d 后统计生根率、苗木长势及根系生长情况。

1.2.5 生根粉对生根培养的影响 以上述生根培养的最佳培养基为基础，添加不同种类和不同浓度的生根粉ABT1(0.5、1.0、1.5 mg·L-1)、ABT3(0.5、1.0、1.5 mg·L-1)、GGR6(0.5、1.0、1.5 mg·L-1)，探讨生根粉对生根培养的影响。每处理接种幼苗100 株，3 次重复。培养30 d 后统计生根率及幼苗长势。

1.2.6 炼苗移栽 生根培养30 d 左右，挑选芽体健壮、生长良好、根系发达、株高2 cm 以上的雷公藤外植体瓶苗，常温闭瓶炼苗3 d，开瓶炼苗3 d，然后将小苗取出，用纯水洗净根系附着的培养基，再将其移栽至消毒基质中，压实、浇透水，隔3 d 喷洒一次1000 倍杜邦亿力。培养过程中注意基质及环境的保温保湿，同时搭建小拱棚遮阴。30 d 后统计成活率。

移栽基质为蛭石、泥炭土等比例混合(1:1)。扦插前一周用0.3%多菌灵与1000 倍杜邦亿力按1:1混合进行封口消毒5 d，然后通风3 d，供培养用。

1.3 数据处理

外植体接入培养基3 d 后开始观察，每隔5 d 观察一次，待培养一个周期(30 d)后进行统计；炼苗移栽阶段，每隔5 d 观察一次，30 d 后统计移栽成活率。

污染率=污染外植体个数/接种外植体个数×100%

萌芽率=诱导芽的外植体个数/接种外植体个数×100%

增殖系数=统计时芽体总数/接种芽个数

生根率=根系萌发外植体个数/接种外植体个数×100%

2 结果与分析

2.1 芽体诱导

由表1 可知，所有处理均能诱导出芽，但萌芽个数及萌芽率存在一定差异，出芽个数主要表现为腋芽增加及顶芽萌发。以处理7(MS + 6-BA 1.5 mg·L-1+ IBA 0.1 mg·L-1)诱导的芽体总数最多，芽苗长势亦最好。

将雷公藤外植体在芽启动诱导一个周期(30 d)后所得的芽体增殖系数进行分析，据均值大小可以判断出各因子最佳组合为：MS + 6-BA 1.5 mg·L-1+ IBA 0.1 mg·L-1，即处理7。极差值大小可反映因子的影响程度，细胞分裂素6-BA 极差值最大，NAA 其次，最后为IBA。因而，各因子对雷公藤芽诱导影响主次关系为：6-BA＞NAA＞IBA。

表1 芽体诱导正交设计L9(34)试验情况Table 1 Orthogonal array of buds induction

2.2 芽体继代增殖

结果表明，芽体增殖系数随6-BA 浓度升高而增大，以MS + 6-BA 1.0 mg·L-1+ NAA 0.1 mg·L-1+ KT 0.5 mg·L-1(处理9)获得芽体数量最多，增殖系数达26.7(表2)。

在芽继代增殖培养一个周期(30 d)后，对增殖系数进行方差极差分析(表2)。根据均值大小可判断各因子最佳使用浓度。芽增殖阶段最佳培养基为：MS + 6-BA 1.0 mg·L-1+ NAA 0.1 mg·L-1。细胞分裂素6-BA 极差值最大，NAA 其次，最后为KT，因而，三者对雷公藤芽增殖影响主次关系为：6-BA＞NAA＞KT。

2.3 壮苗

对芽增殖系数进行方差极差分析，结果显示，壮苗培养过程中，既能让芽苗生长良好，又能使芽体进一步获得增殖的最佳培养基配方为：MS + 6-BA 0.5 mg·L-1+ VB10.5 mg·L-1+ 蛋白胨0.5 g·L-1，即处理6 培养基(表3)。

据表3 可知，生长调节剂及外源添加物不同，外植体长势及芽增殖系数均不同，以处理6 的芽体增殖系数最高，且芽长势健壮、颜色翠绿，因而为雷公藤壮苗培养最佳培养基配方。据极差可知，对雷公藤壮苗培养影响因子的主次关系为：6-BA＞蛋白胨＞VB1。

表2 芽继代增殖培养正交设计L9(34)Table 2 Orthogonal array of buds subculture

表3 壮苗培养正交设计L9(34)Table 3 Orthogonal array of seedling cultivation

2.4 生根培养

对生根率均值极差分析显示，最佳生根培养基组合为1/2MS + NAA 2.0 mg·L-1+ KT 0.1 mg·L-1，各影响因子以基本培养基影响最大，NAA 次之，最后为KT(表4)。

但正交试验处理4 和处理5 的生根率均已达100.0%，且苗木长势好，根系粗壮，生根快，根量多，因此，均适于雷公藤生根培养，操作中可根据实际情况进行适当选择(表4)。

表4 生根培养试验正交设计L9(34)Table 4 Orthogonal array L9(34) of rooting culture

据表5 可知，三种生根粉均可在不同程度上诱导生根，1.0 mg·L-1ABT3(处理5)及1.0 mg·L-1GGR6(处理8) 获得最大根量数，分别为19.4 条、19.0 条；对于ABT1，使用浓度为1.5 mg·L-1时长势最好，平均根量也最多。三种生根粉对雷公藤生根培养最佳培养基组合分别为1/2MS + ABT11.5 mg·L-1+ 蔗糖30 g·L-1+ 琼脂8 g·L-1+ 活性炭 1.0 g·L-1；1/2MS + ABT31.0 mg·L-1+ 蔗糖30 g·L-1+琼脂8 g·L-1+ 活性炭 1.0 g·L-1；1/2MS + GGR61.0 mg·L-1+ 蔗糖30 g·L-1+ 琼脂8 g·L-1+ 活性炭 1.0 g·L-1。

表5 不同生根粉对生根培养的影响Table 5 The effects of different concentration of ABT1, ABT3, GGR6 on rooting culture

2.6 炼苗移栽

雷公藤组培苗移栽培养30 d 后观察发现，组培苗移栽后成活率达84.5%，且苗长势良好、叶片翠绿。因此，本试验炼苗移栽方法适用于雷公藤炼苗移栽。

3 讨论

3.1 芽诱导分化与植物生长调节物质间关系

通常情况下，细胞分裂素与生长素配合使用时，过高的生长素会导致愈伤组织大量产生并且诱导根系形成，对芽的诱导不利，因此进行芽及愈伤组织诱导时，要求高比值的细胞分裂素与生长素[5—8]。本试验中，1.5 mg·L-16-BA 与0.1 mg·L-1IBA 浓度配合利于茎段芽诱导(即细胞分裂素与生长素的比例为15:1)，但添加NAA 对芽诱导没有促进作用，反而有抑制作用。

3.2 继代增殖培养与植物生长调节物质间关系

外源细胞分裂素可破除外植体顶端优势，促进腋芽诱导分化及生长发育。由于外植体在芽诱导过程中，已利用细胞分裂素助其腋芽发生，因而在增殖培养时，可在原先浓度上进行适当降低[5—8]。本试验中，在芽增殖阶段，为了获得较高增殖系数，1.0 mg·L-16-BA 与0.1 mg·L-1NAA、0.5 mg·L-1KT 搭配最佳，增殖系数最高；比较芽诱导培养与增殖培养的细胞分裂素浓度发现，继代增殖培养时，细胞分裂素使用浓度低于启动培养，原因在于内源激素及植物体自身的激素合成能力的影响。

3.3 壮苗培养与植物生长调节物质间关系

研究表明，壮苗培养阶段，培养基中添加一定浓度GA3有利于芽苗增粗生长，同时维生素类及蛋白胨等外源有机添加物均能提高植株生活力。此外，该阶段应降低细胞分裂素用量，防止芽体再次增殖生长[5—8]。雷公藤主要采用细胞分裂素6-BA、VB1及蛋白胨进行壮苗培养。结果显示，三者使用浓度及配比对壮苗培养有显著影响，蛋白胨浓度过高会导致芽苗营养过剩而烧苗，VB1浓度过低不能达到预期效果。

3.4 生根培养与植物生长调节物质间关系

对于生根培养，高离子浓度培养基可能对植物根系产生毒害作用，低离子浓度培养基对生根更有利，因此在使用MS 作为生根培养基本培养基时，可采用1/2MS(大量元素浓度减半，其他成分含量不变)[5—8]。本试验中，生根培养主要采用NAA、KT 两种植物激素。结果表明，三种因素对雷公藤生根率影响的主次关系为基本培养基＞NAA＞KT；在雷公藤生根试验中，低离子浓度利于根系诱导，单一生长调节剂作用效果不明显，应配比相应生长素与细胞分裂素，且两者比值高有利于生根。