Nrf2/Keap1/ARE信号通路和髓核细胞自噬的研究进展

常洪泽，刘晓东

(同济大学附属杨浦医院骨科，上海 200090)

自噬是一种将受损、无用的蛋白质或其他细胞质成分通过溶酶体降解的分子代谢过程，已被定义为对维持细胞稳态至关重要的适应性途径[1]。在自噬过程中，胞质底物被双膜囊泡或自噬体摄取，随后转移至溶酶体进行降解，并在自噬溶酶体(自噬体和溶酶体的融合产物)中再循环[2]。研究表明，自噬涉及各种人类疾病，包括代谢疾病、神经退行性疾病、癌症和传染病等，自噬调节可作为多种疾病的潜在治疗靶点[3]。核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2- related factor 2，Nrf2)是一个重要的保护性转录因子，通过调节与解毒，抗氧化防御和细胞保护等相关基因组的表达介导能量代谢，调控细胞周期和细胞自噬[4]。Nrf2相关信号通路与自噬之间存在复杂的调节机制，探讨两者之间的关系对疾病的治疗具有重要意义。

髓核是一个无血管、无神经组织，髓核细胞数量减少被认为是椎间盘退变的重要特征。在椎间盘退变性疾病的发生、发展过程中，自噬对髓核细胞死亡有重要的调控作用[5]。因此，深入研究Nrf2相关信号通路对髓核细胞自噬的作用为对椎间盘退变性疾病的发生机制和治疗提供新思路。现就细胞自噬在Nrf2相关信号通路以及髓核细胞中的研究进展予以综述，为椎间盘退变的分子机制提供新视角。

1 自噬与Nrf2信号通路的关系

1.1自噬的发生机制 1859年法国生理学家Anselmier在一篇描述小鼠禁食影响的短篇文章中首次使用了术语“自噬”[6]；一个世纪后，比利时科学家de Duve在溶酶体国际会议上从机械的角度解释了自噬[6]。此后，自噬引起了生物界的广泛关注。在正常生理条件下或营养剥夺、生长因子消耗、氧化应激、缺氧等应激条件下都可能引起细胞自噬的发生[7]。自噬是一个协调良好的过程，包括起始、囊泡成核、膜延伸和关闭、成熟和降解4个步骤，这一连续过程受到大约30个自噬相关基因的调控。自噬起始阶段涉及两种蛋白激酶复合体：Unc- 51样激酶1/2(Unc- 51- like kinases 1/2,ULK1/2)复合体和Ⅲ型磷脂酰肌醇- 3- 激酶(class Ⅲ phosphoinositide 3- kinase,PI3KC3)复合物，也称Vps34复合物。ULK1/2复合体由ULK1/2、自噬相关基因13(autophagy related gene 13,Atg13)、200 kD的黏着斑激酶家族相互作用蛋白组成。Vps34复合物由Beclin 1、Atg14、液泡蛋白分选15和Ⅲ型PI3K组成。在营养充足条件下，ULK复合物与雷帕霉素复合物1相偶联，通过磷酸化雷帕霉素复合物1导致ULK1/2失活来抑制自噬[8- 9]。相反，在应激条件下，AMP激活的蛋白激酶通过直接磷酸化ULK1/2或通过结节性脑硬化复合物1/2途径抑制雷帕霉素复合物1激活ULK1/2复合体[10]。被激活的ULK1/2磷酸化并激活Atg13和200 kD的黏着斑激酶家族相互作用蛋白。液泡蛋白分选34复合物组分AMBRA1和Beclin 1 也被ULK1磷酸化而激活[11]。这一系列事件使PI3KC3复合物募集和活化产生“隔离膜”，称为吞噬泡。上述步骤一旦触发后，吞噬泡进入囊泡成核阶段。PI3KC3复合物激活后能使磷脂酰肌醇的第三位羟基磷酸化生成磷脂酰肌醇- 3- 磷酸。然后磷脂酰肌醇- 3- 磷酸结合位于“隔离膜”表面的双FYVE结构域蛋白1和磷酸肌醇相互作用蛋白家族蛋白，导致其成核[12]。吞噬泡的延伸和关闭涉及两类泛素化修饰反应。第一个反应，Atg7(E1样酶)和Atg10(E2样酶)催化Atg12和Atg5(底物)之间偶联。然后，Atg12/Atg5连接物通过非共价与Atg16L相互作用形成四聚体结构[13]。第二个反应，微管相关蛋白1轻链3(microtubule- associated protein1 light chain 3,LC3)首先被Atg4水解成LC3- Ⅰ(胞质形式)，然后Atg12/Atg5/Atg16L复合物介导LC3- Ⅰ与磷脂酰乙醇胺结合生成LC3- Ⅱ(脂化形式)。LC3- Ⅱ促进吞噬泡伸长并随后封闭其内层和外层，导致自噬体的形成[14]。在延伸过程中，衔接蛋白p62/SQSTM1、自噬相关受体Brca 1邻位基因和核点蛋白52 通过与LC3- Ⅱ直接作用介导泛素化细胞质内容物(包括细胞器和聚集蛋白质)的选择性隔离[15- 16]。随后，新生的自噬体沿着微管轨道向周围溶酶体丰富的微管组织中心转移[17]。在转移过程中，自噬体首先与内体囊泡或多泡体(也称amphisomes)融合形成自体吞噬泡，然后与溶酶体融合形成自噬溶酶体，这一过程称为自噬体成熟。自噬体在与溶酶体紧密接近的过程中，涉及栓系因子的协调功能，其中最重要的是可溶性N- 乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体和同型融合及蛋白分选复合物[18- 19]。最后，自噬体内的内容物被溶酶体酸性水解酶消化，产生碱性代谢物，用以实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。质子泵液泡型H+ATPase的激活是溶酶体消化的关键独立步骤[20]。

1.2Nrf2/Keap1/ARE信号通路的概述 核转录因子Nrf2属于CNC碱性亮氨酸拉链家族，包含7个功能域，Neh(Nrf2- ECH同源性)1至Neh7[21- 22]。N端结构域(Neh2)负责Nrf2和Keap1之间的相互作用以及Nrf2的稳定性和泛素化，而Neh5结构域调节Nrf2的细胞定位[22- 23]。具有基本亮氨酸拉链基序的Neh1结构域与下游的抗氧化反应元件(antioxidant responsive element,ARE)序列结合。此外，该结构域还可以与E2泛素结合酶相互作用，调节Nrf2的稳定性[24]。Neh3结构域的C端与转录共激活因子CHD6相互作用，负责染色质重塑后ARE依赖性基因的反式激活[22- 23,25]。Keap1是Nrf2的主要细胞内调节物，包含5个结构域。其中BTB、IVR和DGR结构域对抑制Nrf2活性非常重要。Keap1的KELCH结构域与胞质中Nrf2- Neh2结构域的DLG和ETGE基序结合,结合过程中ETGE作为高亲和力的铰链，DLG充当门闩(铰链- 门闩假说)。在生理条件下，Nrf2与负调节子Keap1结合位于胞质中，通过含有E3的Cul3泛素连接酶，促进Nrf2泛素化继而被蛋白酶体降解，维持较低的水平[26]。在氧化应激或Nrf2激活剂条件下，Keap1的半胱氨酸残基发生巯基化修饰，导致Nrf2与Keap1解离。然后Nrf2易位到细胞核中与小Maf蛋白结合成异二聚体，并激活ARE，启动下游一系列基因的表达[27]。Keap1介导的泛素化及降解是调Nrf2活性的主要途径,但有研究表明，糖原合成酶激酶3β通过激活E3泛素连接酶复合物β- 转导重复相容蛋白- S期激酶相关蛋白1- 滞蛋白1- 环盒子蛋白1指导Nrf2泛素化和蛋白酶体降解。糖原合成酶激酶3β能够使位于Nrf2的Neh6结构域中的丝氨酸残基磷酸化，然后其被β- 转导重复相容蛋白识别，并通过与Cul1蛋白的结合导致Nrf2泛素化和以不依赖氧化还原的方式降解[28]。也有研究揭示了p62依赖的Nrf2激活的非经典途径，p62将Keap1捕获至自噬体降解，使Nrf2处于稳定状态以及Nrf2依赖性基因的反式激活[29]。

1.3自噬与Nrf2/Keap1/ARE信号通路之间的作用机制 自噬与Nrf2之间存在着复杂的调控机制,目前许多分子机制尚不清楚。其中，研究最为广泛的是选择性自噬受体p62在自噬和Nrf2/Keap1/ARE信号通路中的作用。自噬发生时，p62的UBA和LIR发生磷酸化，分别与泛素化蛋白和LC3/Atg8连接，同时通过PB1发生自我聚集，最终与溶酶体融合完成泛素化底物降解[30]。p62蛋白是连接自噬与Nrf2/Keap1/ARE信号通路的桥梁,其KIR结构域与Nrf2的ETGE或DLG结构域相似，当自噬受到抑制时，p62降解受阻而大量积聚。积聚的p62蛋白与Nrf2竞争性结合Keap1，导致Nrf2从Keap1解离同时抑制Keap1- Cul3- E3泛素连接酶复合体使Nrf2发生泛素化降解而激活Nrf2[31- 32]。此外，在氧化应激条件下，Nrf2激活转移入核后可以与p62基因启动子上的ARE结合，使p62高表达[33]。自噬缺陷导致p62积累，p62与Nrf2竞争Keap1,使Nrf2激活,而激活的Nrf2又会促进p62表达,因此形成了一个抗氧化反应的正反馈环路[4]。p62介导的自噬对Nrf2/Keap1/ARE信号通路的作用研究较多，但近年来有实验发现异去氧地胆草素可以通过Nrf2- p62正反馈环路激活保护性自噬维持细胞存活，Nrf2信号通路也可以对自噬进行调节[34]。有研究证明，自噬和Nrf2/Keap1/ARE通路之间存在共同调节途径，PI3K是自噬起始涉及的重要蛋白激酶，Cong等[35]研究表明抑制胞外信号调节激酶和PI3K不仅可以减少Nrf2蛋白的核转移，还可降低Nrf2蛋白的表达。联合抑制胞外信号调节激酶和PI3K也可降低Nrf2靶基因mRNA的表达水平。AMP活化的蛋白激酶是一种高度保守的传感器,其酶活力能够被AMP上调。实验已经证明AMP活化的蛋白激酶通过哺乳动物雷帕霉素靶蛋白和ULK1信号通路调控自噬，并且AMP活化的蛋白激酶诱导激活的Nrf2/SKN- 1传导途径可以改善氧化应激对细胞的损害[36]。

2 自噬在髓核细胞中的作用

下腰痛是一种非常常见的症状。它发生在高收入、中等收入和低收入国家以及从儿童到老年人口的所有年龄组[37]。2015年，活动限制性腰痛的全球患病率为7.3%，意味着全世界有5.4亿人受到影响,腰痛已经成为全球残疾的首要原因[38]。目前下腰痛的病因尚未明确,但椎间盘突出和椎间盘退变是导致下腰痛的两种最常见原因[39]。髓核细胞通过产生Ⅱ型胶原蛋白、蛋白多糖和其他化合物在维持细胞外基质合成与降解的平衡中发挥重要作用，而在椎间盘退变过程中这种平衡被打破[40]。

2.1激活自噬可以抑制髓核细胞退变

2.1.1炎症因子与髓核细胞自噬 自噬作为Ⅱ型程序性细胞死亡发生在组织和器官的发育过程中。在非退行性成年大鼠的髓核细胞中可以观察到低水平的自噬，部分揭示了自噬在正常椎间盘髓核细胞中的生物学作用[41]。然而，在退行性大鼠髓核细胞中自噬水平显著增加[42- 43]。因此，有足够的证据证明退行性椎间盘髓核细胞中存在较高或较低水平的自噬，表明不同病理因素刺激下自噬在椎间盘髓核细胞中可能发挥不同的作用。细胞因子肿瘤坏死因子- α(tumor necrosis factor- α,TNF- α)和白细胞介素- 1β(interleukin- 1β,IL- 1β)加剧的炎症过程被认为是椎间盘退变和下腰痛的关键事件,研究证明细胞因子可以提高基质金属蛋白酶和聚集蛋白多糖酶的水平促进椎间盘细胞外基质的降解[44]。TNF- α和IL- 1β 能够诱导自噬，相应的分子机制可能依赖于细胞类型。TNF- α和IL- 1β能诱导软骨细胞，纤维环细胞自噬[45- 46]，但大鼠髓核细胞在加入TNF- α和IL- 1β 后自噬相关基因在mRNA水平和蛋白水平的表达没有改变。然而，加入核因子κB和c- Jun氨基端激酶抑制剂能够增强大鼠髓核细胞的自噬水平。因此，抑制核因子κB和c- Jun氨基端激酶信号通路能够维持炎症条件下髓核细胞的自噬[47]。白藜芦醇在许多细胞类型中发挥抗TNF- α的作用，Wang等[48]研究结果显示白藜芦醇通过AMP激活的蛋白激酶/沉默信息调节因子2同源物1(silent information regulation 2 homolog- 1，Sirt1)信号通路激活自噬，减弱TNF- α诱导的人髓核细胞中基质金属蛋白酶3的表达。这些发现表明细胞自噬有助于抑制炎症条件下细胞外基质的降解而防止髓核细胞退变。

2.1.2沉默信息调节因子2同源物与髓核细胞自噬 Sirt1对哺乳动物细胞存活和寿命至关重要，在多种疾病中发挥重要作用，并且可作为治疗不同疾病的靶点逐渐被人们重视。Jiang等[49]报道与正常髓核细胞相比，在退行性人髓核细胞中自噬体的数量显著减少，但用Sirt1处理退变的髓核细胞后，通过促进自噬保护退化的人髓核细胞免于凋亡，表明自噬参与Sirt1对髓核细胞凋亡的保护作用。Chen等[50]在衰老的人类髓核细胞中发现Sirt6水平降低，过表达Sirt6可以在体内和体外激活髓核细胞自噬。加入自噬抑制剂3- 甲基腺嘌呤和氯喹后能够部分逆转调节变性相关蛋白表达的Sirt6的抗衰老和抗凋亡作用。结果表明Sirt6通过激活髓核细胞自噬减弱细胞衰老并减少细胞凋亡。因此，Sirt1、Sirt6可能是治疗椎间盘退变的药物靶点。

2.1.3内质网应激与髓核细胞自噬 内质网是真核细胞中重要的细胞器,是新合成跨膜蛋白和分泌蛋白折叠与成熟的加工厂。氧化应激、Ca2+紊乱以及未折叠或错误折叠的蛋白质可以诱导内质网应激反应或未折叠蛋白反应以恢复细胞内稳态[51]。Chang等[52]研究结果表明营养限制诱导髓核细胞凋亡的同时也会激活自噬的发生，早期自噬通过内质网应激的蛋白激酶受体样内质网激酶/磷酸化真核翻译起始因子2α/转录激活因子4通路抑制葡萄糖剥夺诱导的髓核细胞退变。内质网应激介导的髓核细胞自噬可能是防治椎间盘退变的一条新途径。

2.1.4缺氧诱导因子1与髓核细胞自噬 髓核细胞长期处于椎间盘的无血管和缺氧微环境中，通过显著表达缺氧诱导因子1适应缺氧微环境并存活[53]。在各种细胞类型中，缺氧以缺氧诱导因子1A依赖性方式诱导自噬，然而Choi等[54]研究发现低氧显著增加髓核细胞自噬水平，但ULK1在哺乳动物雷帕霉素靶蛋白和AMP活化的蛋白激酶对应的Ser757和Ser777的磷酸化在缺氧时不受影响。当哺乳动物雷帕霉素靶蛋白活性被雷帕霉素或Torin1 抑制时，LC3- Ⅱ水平没有改变。特异性敲除缺氧诱导因子1A小鼠的髓核细胞中LC3阳性自噬体的数量没有变化。该研究首次表明髓核细胞以不依赖哺乳动物雷帕霉素靶蛋白和缺氧诱导因子1A信号转导的非经典方式调控自噬，为髓核细胞自噬的研究提供了新的见解。

此外，也有研究发现瘦素可以通过胞外信号调节激酶- 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路促进自噬抑制人退行性髓核细胞的凋亡[55]。葡萄糖胺通过哺乳动物雷帕霉素靶蛋白依赖性途径诱导髓核细胞自噬可以抑制蛋白聚糖的降解并阻止由IL- 1β诱导的髓核细胞凋亡[56]。

2.2激活自噬可以促进髓核细胞退变 细胞自噬是不同于凋亡的另一种程序性细胞死亡，自噬既能发挥保护作用，也能促进细胞死亡。压力应激是基质周转中涉及的生理刺激，过量负荷可能是发生椎间盘退变的重要危险因素[57]。有研究表明，压力诱导的自噬与细胞内活性氧类的产生密切相关，持续的压力刺激产生大量的自由基，过度的自噬导致髓核细胞死亡[58]。糖尿病是影响许多结缔组织的多器官疾病，包括骨和软骨。高糖可加速髓核细胞的自噬。Jiang等[42]研究发现链脲佐菌素诱导的糖尿病可以通过加速髓核细胞的凋亡和衰老引起椎间盘退变，蛋白质印迹、免疫组织化学和透射电子显微镜显示糖尿病大鼠髓核细胞中的自噬水平显著高于对照组大鼠，表明自噬可能是糖尿病大鼠髓核细胞变化的反应机制，自噬可能加重椎间盘退变。Jiang等[59]研究发现髓核细胞经不同浓度高糖处理72 h后，自噬率增加。与对照组相比，过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator- activated receptor γ,PPARγ)、Beclin 1和LC3- Ⅱ的水平显著增加且p62显著降低。然后，分别用高糖加PPARγ激动剂或PPARγ拮抗剂处理髓核细胞。当使用PPARγ激动剂时，自噬率、Beclin 1和LC3- Ⅱ水平增加，但p62降低。相反，添加PPARγ拮抗剂时，自噬率和Beclin 1和LC3- Ⅱ水平降低，而p62升高。结果表明高糖诱导的髓核细胞自噬是通过PPARγ依赖的途径实现的。这些研究表明,自噬可能加重高糖状态下的椎间盘退变,因此一定程度上抑制髓核细胞自噬可能改善糖尿病患者的椎间盘退变。

3 小 结

自噬和Nrf2/Keap1/ARE信号通路都是细胞重要的防御机制，参与人类多种疾病的发生、发展，两者之间存在复杂的交叉关系，以自噬和Nrf2/Keap1/ARE信号通路为靶点可以为许多疾病的防治提供新思路。自噬在髓核细胞中是一把“双刃剑”，具体作用仍不清楚。因此，探讨自噬在髓核细胞中的作用对椎间盘退变性疾病的发生机制和治疗具有重要意义。Nrf2/Keap1/ARE信号通路在髓核细胞自噬中的作用研究较少，探索两者之间的关系，有助于丰富人们对椎间盘退变发病机制的认识。随着未来对髓核细胞自噬研究的不断深入，调节髓核细胞自噬可能成为延缓或逆转椎间盘退变过程的有效方法。