献血者血袋辫血样本使用国产ELISA试剂检测HBsAg，抗-HCV，HIV Ag/Ab和抗-TP项目的可靠性研究 *

陈少彬，何子毅，刘泽民，陈庆恺，魏润葵，王 庆，邓妙玲

(东莞市中心血站，广东东莞 523930)

2019版《血站技术操作规程》在“血清学检测流程及结果判定”中提出了可选择血袋导管样本进行血清学初次试验为反应性的复试[1]。由于不同血站选择的血液检测策略不同，有报道指出了试管样本(以下简称“试管”)和血袋辫血(以下简称“辫血”)复查的必要性[2]，也有的指出部分辫血复查结果偏低[3-5]。但对于辫血在不同检测项目或试剂的具体偏差尚未明确，特别是弱阳性辫血样本复查的漏检率鲜有报道。在新规程执行二遍酶联免疫吸附法(enzymelinked immunosorbent aasay，ELISA)检测改为一遍ELISA检测前，有必要对血液样本与试剂的检测效果重新进行分析，以评价辫血在检测中的可靠性。笔者回顾性分析血液检测结果，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象 2014年7月1日～2018月11月30日ELISA初筛反应性的无偿献血者血液样本。试管样本采用乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝无分离胶真空采血管，辫血是剪取血袋辫子的血浆(含有血液保养液Ⅲ，主要抗凝剂是枸橼酸钠)。

1.2 试剂与仪器 ELISA试剂盒及主要仪器：HBsAg诊断试剂盒(珠海丽珠和北京万泰)、抗-HCV诊断试剂盒(珠海丽珠和北京万泰)、HIV Ag/Ab诊断试剂盒(珠海丽珠、北京万泰和厦门新创)以及梅毒抗体诊断试剂盒(珠海丽珠、北京万泰和厦门新创)，全自动加样仪(Tecan公司，Freedom evo)，全自动酶免分析系统(Siemens公司，BEPⅢ)，酶标仪(Tecan公司，Sunrise)；一次性使用滤除白细胞血袋(费森尤斯卡比医疗用品有限公司)。所用试剂均在有效期内使用，仪器都经过校准并在正常状态下使用，血液检测操作按试剂说明书或血站制定的相关质量体系文件执行。

1.3 方法

1.3.1 血液检测：血液样本进行两遍不同厂家ELISA的HBsAg，抗-HCV，HIV Ag/Ab和抗-TP同步检测，检测结果以“样本吸光度比临界值”(sample optical density to cut off，S/CO)表示，S/CO<0.9判定为无反应性，S/CO≥0.9判为可疑阳性样本，需对相应项目原试管和辫血进行双孔复试，收集复试的S/CO值。以试管复试结果0.9≤S/CO≤2.0定义为弱阳性样本，其对应的辫血在设置灰区时的临界值为0.9，S/CO<0.9判为无反应性，S/CO≥0.9判为有反应性；在不设灰区时的临界值为1.0，S/CO<1.0判为无反应性，S/CO≥1.0判为有反应性。

1.3.2 分组及数据处理：以不同项目的试剂分组：A，B分别代表HBsAg的丽珠和万泰试剂，C，D分别代表抗-HCV 的丽珠和万泰试剂，E，F，G分别代表HIV Ag/Ab的丽珠、万泰和新创试剂，H，I，J分别代表抗-TP的丽珠、万泰和新创试剂；复试结果的差异计算：差值=“试管S/CO值”-“辫血S/CO值”；辫血的相对漏检率(%)=辫血复试检测值小于临界值的样本数/总样本数×100%。

1.4 统计学分析 采用SPSS19.0软件进行分析。非正态分布数据采用中位数(P25，P75)表示，S/CO值偏差分析采用配对Wilcoxon秩和检验，组间率的比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 辫血与试管的检测值偏差分布情况 见表1。各组的差值经正态性检验均为非正态分布，集中程度用中位数表示，误差线以四分位数表示，作散点图见图1，除抗-HCV 的D组辫血S/CO值大于试管结果(P<0.05)外，其它9组辫血结果均小于试管结果(P<0.05)。

表1 辫血与试管在不同组间的S/CO值结果比较

注：M为试管与辫血S/CO值之差的中位数。

注：# 表示差值>0，经Wilcoxon带符号秩检验P<0.05；* 表示差值<0，经Wilcoxon带符号秩检验P<0.05。

图1试管与辫血在不同检测项目S/CO差值的散点图

2.2 弱阳性辫血样本的检测情况 见表2。辫血复试值偏低，最大的是F组0.651(0.206，0.886)，最小的是D组0.016(-0.168，0.232)。各组设置灰区前、后，辫血的漏检率除了J组差异有统计学意义外(P<0.05)，其他9组试剂虽在数量上有所下降，但差异均无统计学意义；设置灰区后，实际的漏检率最大的是F组为60.67%，最小的是E组7.41%。

表2 弱阳性辫血样本的检测值偏差和设置灰区前、后的漏检情况

注：M为试管与辫血S/CO值之差的中位数。

3 讨论

血站实验室处于某种需要，对初次反应性献血者复试的实际操作可能不同。“双孔复试”的做法可能衍生出三种模式，即对试管血双孔复检、对血袋辫血进行双孔复检以及试管血和辫血同时复检[6]。本站采用上述第三种，同一献血者来源的2份样本的试验过程均保持一致性，即在同1操作者、试剂和仪器检测，排除了检测中的差异因素，为比较和量化辫血与试管的差异提供必要基础。从总体的检测结果分析，分析各组的辫血与试管的S/CO值之差，其分布并非正态性分布，说明样本的成分存在差异，同时也反映样本中所含标志物的浓度不同，在同一种试剂的信号值也存在差异。研究发现，只有抗-HCV万泰组辫血的S/CO值是大于试管的(P<0.05)，其他9组均为辫血低于试管(P<0.05)。原因可能与不同检测项目试剂的实验原理、试剂原材料及各原料成分配置比例不同有关。抗-HCV万泰试剂采用双抗原夹心法，同时使用生物素-亲和素，其信号放大作用较强，试管终止后颜色太浓稳定性反而差，或者可能与样本的抗凝剂干扰有关[6]。对于辫血检测值偏低的现象，是否导致血液检测的漏检，这是实验室关心的重点。

由于实验误差的存在，标志物浓度在临界值附近的样本的漏检几率较大。因此选取试管复试值在0.9≤S/CO≤2.0的弱阳性样本为研究对象，而强阳性样本，即使辫血信号值低于试管，但仍能被检出，符合预期反应性的结论，故无漏检影响。通过分析发现，弱阳性辫血样本的检测值差异程度越大，如表2的F组，其差值的中位数达到0.651(0.206，0.886)，远大于表1的总体差值0.260(0.000，0.988)。即使是差值<0的D组，差值也由总体的-0.144变为0.016。而本实验室设置的灰区范围仅为0.10，说明用弱阳性辫血样本进行复试，有可能导致更高几率的漏检，因此评估灰区设置与漏检率的关系尤为重要。

通过对弱阳性辫血的漏检率分析，结果显示各组的漏检率7.41%～60.67%，与文献报道的26.27%(31/118)[3]和14.9%(39/262)[7]不同。其中HBsAg项目A组和B组的漏检率分别是31.45%和46.88%，与王新梅[8]报道的HBsAg新创试剂漏检率46.15%接近，但低于其科华试剂漏检率67.50%。这可能与所用试剂的检测性能不同有关。在灰区设置前、后辫血的漏检率比较发现，只有抗-TP的J组漏检率差异有统计学意义(P<0.05)，其他9组在设置灰区前后的漏检率无差异(P>0.05)(表2)，说明现用灰区设置范围对辫血信号值低，起不到拦截作用，或者说弱阳性辫血不适用于复试。

造成辫血结果偏低的主要原因是样本被血液保养液稀释。以本站为例，辫血并非最初采血结束时的血液状态，而是经过去白细胞过滤后与保养液充分混匀的血液。如400 ml血袋中有保养液56 ml，按血细胞比容的正常值(男性：0.4～0.5，女性：0.35～0.45)估算，血浆约200～260 ml，除去细胞等有形成分，血浆被稀释到原来的78.13%～82.28%，潜在的标志物浓度理论上平均降低了20%。由于ELISA受试剂本身性能、样本内源性或外源性干扰物质、抗凝剂等影响[6，9-10]，稀释后的血浆检测值与稀释倍数并非线性关系[11-12]，实际检测值可能更低于理论值。个别血站出于质量管理方面的需要，仍然采用辫血复试，目的是为了防止采血部门在留取样本时“张冠李戴”[6]以及验证二遍ELISA检测结果不符等。这种“弥补式”的管理方式与实验室追求检测结果准确性的质量方针不符，应从差错的源头加大过程管理，强化特定环节的质量控制。本研究不足之处是对灰区设置和漏检率的估算是基于日常检测数据，弱阳性样本未得到确证，仅以潜在感染性标本对待。因此，若血站实验室执行“原血样不符合要求，再从血袋导管重新取样”[1]的操作，须根据实际情况评估辫血的可靠性。

综上，辫血的复试结果普遍低于试管，用于血液检测可能存在漏检风险。在新的血液检测形势下，血站实验室可根据实际情况适当调整血液复试流程或灰区设置，联合更高灵敏度和特异性的核酸检测试剂，提高血液安全性。