SNP-array分析在超声波检测颈项透明层增厚胎儿的遗传学诊断中的应用 *

欧阳鲁平，刘文慧，覃秀云，王 锦，孙惟佳

(1.广西壮族自治区妇幼保健院遗传代谢中心实验室，南宁 530001；2.桂林医学院第二附属医院检验科，广西桂林 541100；3.南宁市第四人民医院超声影像科，南宁 530023)

颈项透明层(nuchal translucency，NT)指妊娠11～13+6周胎儿颈后皮下液体积聚的厚度，在超声影像上是胎儿颈后皮下的无回声带，为妊娠早期筛查胎儿染色体非整倍体异常的重要指标，被广泛应用于临床。研究报道，NT增厚不仅与胎儿染色体异常有关，还与胎儿严重心脏畸形、某些胎儿遗传疾病等密切相关[1]。单核苷酸多态芯片(single nucleotide polymorphism array，SNP-array)技术是新兴的分子核型检测技术，具有众多优势：如高分辨率、高通量、高敏感性和高准确性等，优于传统的G显带检测方法。本文对130例NT≥3.0 mm的胎儿进行产前诊断，在染色体核型分析基础上加上SNP-array芯片技术检测，并随访其妊娠结局，探讨SNP-array芯片技术检测对胎儿NT增厚胎儿产前诊断的临床意义，为临床决策、预后评估和遗传咨询提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象 取自2017年1月～2018年6月，在广西壮族自治区妇幼保健院医学遗传门诊就诊的孕妇，行早孕期超声筛查的130例11～13+6周NT增厚(NT≥3.0 mm)胎儿，行介入性产前诊断，绒毛取样活检术。行染色体核型及SNP-array检测，孕妇签署知情同意书后，随访记录妊娠结局。

1.2 仪器与方法

1.2.1 仪器：应用GE Voluson E8，Philips iu22，Siemens ACUSON Sequoia 512及S200彩色多普勒超声诊断仪，经腹部超声检查探头频率2.0～6.0 MHz，经阴道超声检查探头频率5.0～8.0 MHz；超净工作台，CO2细胞培养箱，定时烘箱，医用低速离心机，高速离心机(Labnet，美国)，PCR扩增仪(ABI，美国)，iScan(illumina，美国)，高速冷冻离心机(Thermo，美国)，Lab-Aid 820核酸提取仪(厦门至善，中国)等。

1.2.2 超声筛查NT测量方法：检查前向孕妇告知孕11～13+6周胎儿超声筛查的重要性与局限性，并签署知情同意书。NT测量在正中矢状切面上进行，胎体自然屈曲，尽可能放大图像，仅显示胎头和上胸部，使游标尺的轻微移动只改变测量结果的0.1 mm。测量时注意辨别胎儿皮肤及羊膜。测量颈后皮下无回声带的最大厚度，至少测量3次，取最大值。

1.2.3 介入性产前诊断：130例孕妇于孕早期11～13周经腹行胎儿绒毛活检术，抽取绒毛组织25 mg。

1.2.4 绒毛DNA提取：采用QIAamp DNA Blood Mini Kit(Qiagen，德国)试剂盒来提取基因组DNA，并运用SNP-array检测；NanoDrop2000(Thermo Fisher scientific INC，美国)测定DNA浓度，需要保证DNA浓度大于50 ng/L，A260nm/A280nm处在1.8～2.0范围。

1.2.5 绒毛染色体核型分析步骤：倒置解剖镜按照本实验室制定绒毛分离法[2]，分离出干净的绒毛标本，常规培养，观察，收获标本，适宜环境下滴片，80℃烤6h，采用G显带，显微镜下计数与分析。显微镜下计数20个核型，分析5个核型，遇到嵌合体加倍计数。

1.2.7 SNP-array检测：应用美国Affymetrix CytoScan 750K芯片平台对这些样本进行基因拷贝数变异(CNVs)分析。实验操作严格按照Affymetrix公司提供的操作流程。用Affymetrix 7G扫描仪扫描芯片，扫描信号图经过Affymetrix的Chas软件分析和计算。

1.2.8 SNP-array检测的判断和评价：数据分析参照本实验室内部数据库以及DGV，DECIPHER，UCSC，OMIM等公共官网数据库。

1.3 统计学分析 根据NT值统计所有入选病例的染色体核型与SNP-array检测结果，随访胎儿异常情况及妊娠结局。应用SSPS19.0软件进行分析，资料分析采用卡方检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 染色体核型分析 130例胎儿NT增厚病例行绒毛膜取样活检。95例染色体核型正常，35例染色体核型异常(26.9%)，其中13-三体5例；18-三体8例；21-三体10例；45，X：3例，47，XXX：1例；47，XYY：1例；嵌合体3例；46，XY，inv(9)(p12q13)：2例；46，XY，der(11)t(4；11)(q28.1；q24.3)：1例；46，XY，der(14；21)(q10；q10)，+21：1例。

2.2 SNP-array检测结果 130例胎儿NT增厚病例行绒毛膜取样活检，提取DNA行SNP-array检测。86例基因芯片拷贝数正常，44例基因芯片拷贝数异常(33.8%)。

2.3 基因芯片与核型分析对绒毛标本检出异常情况 核型分析检出遗传异常35例，基因芯片检出异常44例，两种技术检出率差异有统计学意义(χ2=6.23P<0.05)；同时染色体核型分析结果与基因芯片结果不一致以及随访结果。11例超声波指征为：NT增厚，结果见表1。

表1 11例SNP部分微缺失、微重复的阳性结果

3 讨论

NT测量是早孕期最简单有效的提示胎儿染色体异常的筛查方法之一。2004年，英国胎儿基金会建议早孕期产前筛查内容包括孕妇年龄、NT三项、血清学筛查，可使21-三体综合征的筛查率高达80%～90%之间。最近几年国内对于NT检查在染色体非整倍体的筛查作用也给予了肯定[3]。此外，NT异常与心脏畸形、不良妊娠结局、发育迟缓等也有相关性[4]。对于NT增厚的具体生理机制目前尚无明确的理论解释，主要有以下观点[5]：与胎儿染色体的异常、贫血及低蛋白血症、淋巴系统异常和回流受阻、颈部淋巴回流障碍，过多的淋巴液积聚于颈后胎儿心脏畸形继发心力衰竭有关。国外学者研究发现 NT增厚的胎儿中14.2%并发染色体异常[6]。NT增厚染色体正常的胎儿，其不良妊娠结局的发生率随着NT测量值的增高而增高，主要表现为先天性心脏病[7-9]。

传统的染色体核型分析需要经过细胞培养、制片、染色等复杂手段，且其分辨率一般为5M～10M。但小于5M的小片段的拷贝数变异(copy number variations，CNV)，常规核型分析技术难以发现。并且染色体培养的过程较困难，存在一定的细胞培养失败概率，为后期的分析和发报告造成困难。基因芯片检测是近年发展起来的分子生物学检测方法，其特点是分辨率高、检测速度快、检测通量高，可分辨出100K以内的染色体片段变异。由于该基因芯片检测不需要进行细胞培养，因此其适用于细胞培养较难成功的检测样本，或者有明显症状但常规核型分析未检出异常的样本。染色体微阵列分析技术包括基于微阵列的比较基因组杂交(array based Comparative Genomic Hibridization，aCGH)技术和单核苷酸多态性微阵列技术，能够在全基因组水平进行检测染色体不平衡的拷贝数变异，且较染色体核型分析具有更高的分辨率和敏感度，目前广泛应用于胎儿异常的产前诊断。单核苷酸多态芯片(array single nucleotide polymorphism，array-SNP)技术是一项新兴的分子分析技术，能够在全基因组水平进行扫描，检出100kb以下的基因拷贝数变异，除了能检出非整倍体异常，还能检测核型分析无法发现的低水平拷贝数变异、染色体杂合性缺失等拷贝数正常的染色体异常，进一步检测出染色体微缺失或微重复所涉及的基因、发生的位置以及片段大小，优于传统的G显带检测方法。但目前基因芯片无法分析染色体的结构变异[10]，本文中染色体核型除了检出13-三体5例，18-三体8例，21-三体10例，45，X：3例，47，XXX：1例，47，XYY：1例，嵌合体3例，还检出2例46，XN，inv(9)(p12q13)，这是芯片检测技术不能检出的，因此在产前诊断时基因芯片检测与常规染色体分析同时实施检测。SNP-array检测技术能提高致病性CNVs的检出率，建议NT增厚胎儿应同时行传统染色体核型和SNP-array检测分析。

本研究通过检测130例胎儿NT增厚的胎儿样本，染色体核型异常检出35例，检出率26.9%(35/130)，SNP-array检出44例异常，检出率33.8%(44/130)，SNP-array异常检出率明显高于染色体核型异常检出率，并且差异具有统计学意义(P<0.05)。对彩色多谱勒胎儿NT增厚的胎儿样本，SNP-array检测有助于发现染色体核型分析无法检出的染色体亚显微结构异常，SNP-array有利于提高对NT增厚胎儿遗传病因的诊断。应用SNP-array检测胎儿NT增厚样本进行检测，异常检出率提高了6.9%，稍微低于杨鑫等[11]人报道的7.69%，但SNP-array技术可明显提高疾病的诊断率。SNP-array检测不经细胞培养，少量胎儿组织的基因组DNA就达到检测目的，有助于排除致病性染色体微缺失/微重复综合征，避免患儿出生，得以减少出生缺陷率。本文中共计有9例绒毛染色体核型结果未见异常，而芯片检出染色体微缺失、微重复，4例为染色体微缺失，其中2例涉及16号染色体上微缺失，检测为α-珠蛋白生成障碍性贫血，有研究称，NT增厚对胎儿染色体异常、心脏畸形和重型α-珠蛋白生成障碍性贫血等多种异常有较好预测价值[12]；4例为染色体微重复，以及1例父源性9号染色体单亲二倍体。故在核型分析的基础上进行SNP-array检测除了能避免胎儿染色体平衡重组、以及低比例嵌合及多倍体的漏诊风险，对染色体核型明确诊断出来的非整倍体异常样本，则需再行SNP-array检测分析，为患者减轻经济负担。王敏等[13]发现，对NT异常的胎儿产前诊断可使用染色体核型分析联合染色体微阵列检测形式，可覆盖染色体微缺失微重复，对产前诊断具有重要指导意义。NT增厚易致围生儿死亡，有研究称NT增厚的病例可预后不良，但仍有近一半NT增厚的病例在后期的随访消失，当排除胎儿染色体方面异常及结构异常，单纯NT增厚仍然可健康存活[14-15]。

综上所述，通过核型分析与SNP-array检测能覆盖大部分染色体的异常，SNP技术则对致病性CNV检出有明显优势。但仍存不足，在染色体平衡易位、染色体倒位的检测中具有不可替代的作用[16]。NT增厚作为产前检测的重要指征，行常规染色体核型分析并行SNP分析，以获得更多的遗传学信息，为NT增厚预后评估及遗传咨询提供更优的临床决策。